Методическая статья

Нанодиафродная сканирующая флуориметрия для скрининга при обнаружении свинца на основе фрагментов

6.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62469

⸱

16 мая 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Oncode Institute and Division of Biochemistry, the Netherlands Cancer Institute, 2Institute for Organic Chemistry and Chemical Biology, Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ), Johann Wolfgang Goethe-University

В этой статье

Краткое содержание

Мониторинг изменений температуры плавления белка-мишени(т.е.анализ теплового сдвига, TSA) является эффективным методом скрининга библиотек фрагментов из нескольких сотен соединений. Мы представляем протокол TSA, реализующий нанодиаппаратную сканирующую флуориметрию с помощью робототехники (nano-DSF) для мониторинга внутренней флуоресценции триптофана и обратного рассеяния света для скрининга фрагментов.

Аннотация

Анализы теплового сдвига (TSA) исследуют, как температура плавления (Tm)белка-мишени изменяется в ответ на изменения в его среде(например,буферный состав). Полезность TSA, и в частности нано-дифференциальной сканирующей флуориметрии (nano-DSF), была установлена на протяжении многих лет, как для поиска условий, которые помогают стабилизировать конкретный белок, так и для просмотра связывания лигандов путем мониторинга изменений в кажущемся Tm. В данной работе представлен эффективный скрининг библиотеки фрагментов Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) (768 соединений) с использованием нано-DSF, мониторинга Tm для идентификации потенциального связывания фрагментов. Предпосылки в отношении качества и концентрации белка для проведения экспериментов с нано-DSF кратко изложены, за которым следует пошаговый протокол, который использует нанолитровой роботизированный дозатор, обычно используемый в лабораториях структурной биологии для подготовки необходимых образцов в 96-скважинных пластинах. Протокол описывает, как смеси реагентов переносятся в капилляры, необходимые для измерений нано-DSF. Кроме того, в данной работе представлены протоколы измерения тепловой денатурации (мониторинг внутренней флуоресценции триптофана) и агрегации (мониторинг обратного рассеяния света) и последующие этапы передачи и анализа данных. Наконец, обсуждаются скрининговые эксперименты с тремя различными белковыми мишенями, чтобы проиллюстрировать использование этой процедуры в контексте кампаний по обнаружению свинца. Общий принцип описанного способа может быть легко перенесен в другие библиотеки фрагментов или адаптирован к другим инструментам.

Введение

Программы открытия лекарств часто начинаются с скрининга химических соединений на их способность взаимодействовать и / или изменять функцию мишеней лекарств, чаще всего белков. Так называемые «хиты», которые встречаются на таких экранах, закладывают основу для открытия новых лидов и кандидатов на разработку, а также для большинства новых лекарств, которые лицензизуются в наши дни. Таким образом, наличие высокопроизводительных методов необходимо для скрининга огромного количества доступных целей с огромным количеством различных соединений, чтобы быстро идентифицировать их тесную связывание или их способность модулировать определенную функцию цели. После того, как удары идентифицированы, наиболее перспективные комбинации попадания-цели выталкиваются в обширный конвейер разработки лекарств с использованием других, часто дорогостоящих и трудоемких технологий, чтобы понять «отношения структуры и активности» (SAR).

Подходы структурной биологии, такие как те, которые предлагаются финансируемыми ЕС программами доступа «Инфраструктура для ЯМР, ЭМ и рентгеновских лучей для трансляционных исследований» (iNEXT) и его нынешним преемником iNEXT-Discovery, часто используются для изучения взаимодействий многочисленных соединений в мельчайших деталях, улучшая при этом аффинность и фармакологические свойства первоначальных попаданий обычно несколькими раундами синтетической химии1. Свинцовые соединения, которые появляются в результате этих кампаний «от удара к ведущему», становятся кандидатами на развитие и входят в доклинические исследования. Хорошо разработанная методология молекулярного скрининга может быть примерно разделена на два подхода, а именно открытие свинца на основе лигандов (LBLD) и обнаружение свинца на основе фрагментов (FBLD). В кампаниях LBLD белковые рецепторы проверяются либо несколькими тысячами отобранных вручную лигандов (на основе структуры естественных лигандов или структуры мишени), либо многими десятками тысяч соединений в библиотеках лигандов, подобных лекарственным средствам, которые охватывают большую часть химического пространства.

Обычно соединения проверяют на их ингибируемую активность в анализе активности, обычно контролируя ферментативную функцию. Однако в кампаниях FBLD2,3,4,5некоторые сотни соединений, которые обычно меньше, чем лекарства (100-200 Дальтон), проверяются на их способность связывать мишень напрямую, без использования анализа активности. Это связывание может влиять на целевую активность и может быть измерено многими биофизическими методами, которые сообщают непосредственно о способности фрагментов связываться с мишенью, или структурными методами, такими как рентгеновская кристаллография6 и спектроскопия ядерного магнитного резонанса7,а в последнее время также криоэлектронная микроскопия. Когда фрагменты связываются в разных местах, которые близки друг к другу на белке, различные, обычно низкоаффинные связывающие фрагменты могут быть рационально объединены химически, чтобы создать небольшой набор отведений, которые могут быть изучены более подробно. Это часто приводит к более высоким аффинным, более мощным соединениям, и эта методология начала давать важные молекулы с клиническим потенциалом. Выбор «идеальной» библиотеки фрагментов, эффективно эксплуатирующих химические группы, был активной областью исследований в течение многих лет8,9,10.

В то время как первоначально акцент был сделан на охвате всего химического пространства, последующее внимание было сосредоточено на том, чтобы позволить последующему химическому сочетанию попаданий фрагментов производить соединения свинца. Такие исследования привели к так называемым «уравновешенным» библиотекам. Они содержат фрагменты, по крайней мере, с одной функциональной группой, которые позволяют быстро и дешево проводить последующую синтетическую химию для эффективного прогресса в изучении SAR. Одним из мероприятий, катализируемых iNEXT, было обновление уравновешенной библиотеки, разработанной исследователями в Консорциуме алмазных источников света и структурной геномики. Эти совместные усилия привели к библиотеке DSi-Poised11,которая также была проверена в iNEXT12. Позже эта библиотека была приведена в соответствие с наличием соединений в базе данных REAL Enamine Ltd., химической исследовательской организации и производителя больших коллекций строительных блоков и библиотек соединений для скрининга. DSi-Poised теперь доступен для покупки любому, но также доступен во многих партнерских лабораториях iNEXT-Discovery для поддерживаемых проектов по скринингу фрагментов.

Высококачественные технологии рентгеновской кристаллографии и структурной биологии ЯМР имеют свои преимущества и недостатки для FBLD. Оба требуют изолированных целевых образцов и дают атомарные детали с высоким разрешением, которые необходимы для FBLD. Однако кристаллы необходимы для рентгеновской кристаллографии, и фрагменты связываются с полостями в хорошо упорядоченных белковых областях, которые не участвуют в построении трехмерной кристаллической решетки. Раствор ЯМР часто дает различные удары от рентгеновской кристаллографии, так как он не подвержен влиянию кристаллической среды и хорошо обнаруживает связывание также в частично упорядоченных белковых областях. Однако, хотя эксперименты с ЯМР на основе лигандов относительно быстры, они по-прежнему требуют значительного количества времени и материала и обычно могут проводиться только для относительно небольших белковых мишеней или доменов. С целью приоритизации соединений для кристаллографических или ЯМР-экспериментов были использованы биофизические подходы13,14,15.

Поскольку последние приборы и вычислительные протоколы позволяют эффективно кристаллографический скрининг для FBLD путем определения структур и анализа ~ 1000 фрагментов очень эффективно, эта приоритизация стала менее важной в рентгеновских исследованиях. Однако для ЯМР по-прежнему желательно использовать более дешевые и быстрые эксперименты для приоритизации библиотечного скрининга и экономии времени приборов на оборудовании самого высокого уровня. В то же время использование комбинации принципиально разных технологий может обеспечить независимое подтверждение событий связывания или даже дополнительные попадания, которые не улавливаются при использовании только кристаллографии или метода ЯМР. Кристаллографические и ЯМР-методы требуют очень дорогого оборудования и часто могут быть выполнены только в специализированных внешних учреждениях с помощью местных, высококвалифицированных экспертов. Кроме того, правильный анализ результатов также требует высокой квалификации. В то время как такие программы, как iNEXT и iNEXT-Discovery, демократизируют доступ к таким объектам16,было признано, что дешевый, быстрый и высокопроизводительный скрининг FBLD другими методами может стимулировать программы скрининга лекарств в гораздо более широком круге лабораторий. Такие результаты затем могут быть использованы в качестве показаний для налаживания сотрудничества с химиками-медицинскими химиками и для приоритизации наиболее дорогих скрининговых экспериментов с наиболее перспективными соединениями, если ЯМР и кристаллография налагают ограничения на количество соединений, которые могут быть проверены.

TSA формирует быстрый, эффективный и относительно дешевый и доступный биофизический метод17, который может быть использован для скрининга FBLD. Он использовался в нескольких условиях, от помощи в поиске стабильных белковых условий для испытаний кристаллизации18до поиска соединений, которые связываются с конкретными мишенями в клетках19. TSA также использовались для измерения констант диссоциации для лигандов, связывающих белки-мишени, поскольку связывание лигандов часто приводит к изменениям термической стабильности. Во всех ТСА изменение температуры денатурации белка (его стабильности) измеряется как функция медленного повышения температуры. Эффективным способом отслеживания денатурации белка при нагревании является DSF или Thermofluor, который количественно определяет флуоресцентное гашение гидрофобного красителя (обычно Sypro Orange) при взаимодействии с открытыми гидрофобными областями белка, которые разворачиваются из-за повышения температуры.

Nano-DSF обычно относится к измерению термической стабильности белка при отсутствии внешних красителей. Одним из первых инструментов, которые предложили такую возможность, был OPTIM1000, который измеряет широкий спектр интенсивности света, а также рассеяние света образца. Эта машина позволяла одновременно измерять развертывание белка (обычно после флуоресценции триптофана) и агрегацию белка (поскольку образованные наночастицы приводят к увеличению рассеяния света при ~ 400 нм). Позже «Прометей» ввел использование обратного отражения для измерения агрегации и чувствительного обнаружения флуоресцентного сигнала, что позволило отсеять низкие концентрации белка с хорошей чувствительностью20. В следующем разделе описывается, как Prometheus использовался для демонстрации протокола скрининга фрагментов для обнаружения попаданий для различных белковых мишеней. Краткое введение об ожидаемом качестве и количестве белка сопровождается пошаговым протоколом подготовки, выполнения и анализа экспериментов по скринингу фрагментов. Результаты скрининга трех белков были показаны в качестве примера данных, полученных в рамках сотрудничества iNEXT-Discovery.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Белки, используемые в экспериментах nano-DSF, должны быть чистыми (>95%) и однородными, если судить по электрофорезу додецилсульфат-полиакриламидного геля. Перед выполнением фрагментарного экрана следует определить стабильность белков в различных буферных условиях. Следует использовать низкий ионный буфер, низкий солевой буфер, который минимально мешает белку, чтобы не влиять на его прямое взаимодействие с фрагментами. Буферы, обычно используемые в этом протоколе для проверки стабильности, показаны в дополнительной таблице S1. Концентрация белка, который необходимо использовать для этого эксперимента в качестве запасного раствора, обычно составляет 0,2 мгмл-1. Для скрининга всей библиотеки DSi-Poised (768 соединений) необходимо в общей сложности ~ 12 мл белка этой концентрации, в общей сложности ~ 2,5 мг. Библиотека DSi-Poised, используемая в этих экспериментах, была предоставлена в формате 96 скважин(рисунок 1). Концентрацию фрагментов корректировали до 100 мМ в 20% v/v диметилсульфоксиде (DMSO). Следует отметить, что протокол смешивания, описанный здесь, приводит к низким конечным концентрациям ДМСО 0,4% v/v; хотя это вряд ли повлияет на стабильность белка, эффект ДМСО следует проверять для каждого нового белка.

figure-protocol-1
Рисунок 1:Типы пластин, используемых для этих экспериментов. (A) U-нижняя пластина. (B) 96-скважинная плита. (C)Крупный план 96-скважинной плиты, показывающей подзабочную скважину 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Подготовка пластин

  1. Выньте фрагментную пластину из морозильной камеры -20 °C /-80 °C и дайте ей оттаять при комнатной температуре, с легким встряхиванием на настольном шейкере. Центрифугировать пластину при 500 × г в течение 30 с, чтобы собрать любые капли, прилипающие к боковой части колодцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку библиотека фрагментов доступна растворенной в DMSO-d6 (температура плавления 19 °C), важно убедиться, что каждое соединение полностью разморожено и солюбилизировано.
  2. Возьмите кристаллизуальную пластину MRC 2-скважины(рисунок 1A)и пипетку 14,7 мкл раствора белкового запаса в каждую подлунку. Чтобы сделать это эффективным по времени способом, храните белок в резервуаре реагента(Таблица материалов)и используйте многоканальную пипетку для дозирования(Рисунок 2A,B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для библиотеки DSi-Poised, в зависимости от формата, не все скважины пластины из 96 скважин содержат соединения. Как правило, строки A, H и столбцы 1, 12 заполняются DMSO. Таким образом, строки A, H и столбцы 1, 12 не должны заполняться белком, так как эти колодцы не будут содержать никаких фрагментов в конце следующей ступени; только DMSO будет передан туда роботом. Обратите внимание, что пустые строки и столбцы отличаются в некоторых пластинах.

figure-protocol-2
Рисунок 2:Схема процедуры скрининга фрагментов. (A) Использование многоканальной пипетки и резервуара реагента для дозирования белка. (B) Дозирование белка в 96-колоденой пластине. (C) Дозирование фрагментов роботом-дозатором. (D) Загрузка белка в капилляры. (E) Ящик с капилляром. (F)Вид капиллярного держателя крупным планом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-3
Рисунок 3:Обзор оборудования, используемого в этих экспериментах. (A) Робот-нанодизер, используемый для дозирования фрагментов. Указаны положения пластин. (B) Программный интерфейс для определения новой пластины. (C) Интерфейс дозирующих программ. (D) Программа дозирования, используемая для дозирования фрагментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Фрагмент нано-дозирования роботом Mosquito

  1. Проверьте тип пластины, в которой поставляются фрагменты (Таблица материалов).
  2. Проверьте определения фрагментов и белковых пластин на Комаре.
    1. Включите нанораспределенный(рисунок 3А). Убедитесь, что вокруг движущихся компонентов нет препятствий.
    2. Откройте графический интерфейс пользователя, перейдите на вкладку Setup и в разделе Deck Configuration (Конфигурация палубы)проверьте, присутствует ли уже в списке Доступных пластин тип пластины,в которую поставляются соединения, и та, в которой белок был перенесен в разделе 1. Если нет, нажмите кнопку Параметры| Пластины и создайте новое определение пластины, заполнив правильные значения для типа Property (рисунок 3B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти значения для плиты MRC 2 и плиты из 96 скважин, используемых в этом эксперименте, приведены в дополнительной таблице S2 и дополнительной таблице S3,соответственно.
  3. Программа дозирования
    1. На вкладке Настройка укажите положение пластин в разделе Конфигурация палубы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Москит, используемый в этом эксперименте, имеет два положения пластин на палубе. Позиция 1 определяется как опора источника,а позиция 2 — пластина назначения.
    2. Используя раскрывающееся меню, выберите нижнюю пластину Greiner U для позиции 1 и пластину MRC 2для позиции 2 (рисунок 2C). Сохраните протокол.
  4. Дозирование фрагментов
    1. Поместите фрагментную пластину в положение 1, а белковую пластину в позицию 2 колоды(рисунок 3А).
    2. На вкладке Протокол (Рисунок 3D) нажмите файл и выберите протокол, сохраненный в разделе 2.3 для дозирования фрагментов. Определить объем фрагментов, которые будут дозироваться; использовать 0,3 мкл. Для типичной пластины, где столбцы 1 и 12 не содержат фрагментов, определите начальное расположение для столбца 2 и расположение в конце для столбца 11. В некоторых листах, если столбцы 2 или 11 пусты, используйте столбцы 3 и 10 в качестве начального и конечного значений соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за настройки Mosquito можно пропускать только столбцы, а не строки; для рядов комар будет пипеткой DMSO. Убедитесь, что параметр Изменение подсказок выбран как Всегда,чтобы не загрязнять библиотеку фрагментов перекрестным образом.
    3. Нажмите кнопку Выполнить, чтобы запустить программу. После дозирования, которое занимает ~2 мин, удаляют белковые и фрагментные пластины из робота, и запечатывают их обратно клейкой герметизной пленкой. Кратковременно центрифугируют белковую пластину (500 × г,30 с), чтобы собрать любые капли, прилипающие к боковым сторонам колодцев, прежде чем перейти к следующему этапу.

3. Измерение нано-DSF

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описание выполнения TSA с использованием Prometheus NT.48 было опубликованоранее 20. Здесь упоминаются важные моменты в контексте фрагментного скрининга.

  1. Проверка пластин перед измерением
    1. Визуально осмотрите колодцы белковой пластины на предмет осадков, которые могли произойти из-за добавления фрагментов. Если осадки наблюдаются во многих скважинах, уменьшите концентрацию осколков и повторите эксперимент.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется держать белковую пластину при комнатной температуре; фрагменты, как правило, становятся нерастворимыми при более низких температурах.
  2. Подготовка Прометея
    1. Включите инструмент «Прометей». На сенсорном экране нажмите Открыть ящик для доступа к капиллярному загрузочному модулю инструмента. Снимите магнитную полосу с загрузочного модуля и очистите зеркало этанолом, чтобы удалить частицы пыли.
  3. Перенос с белково-фрагментной пластинки в капилляры
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап включает перенос образца смешанного белка/фрагмента из каждой скважины в белковой пластине в капилляры для использования с Прометеем. Для этого, хотя обычно используется стандартный капиллярный тип, можно использовать капилляры высокой чувствительности для очень низких концентраций белка.
    1. Поместите белковую пластину и капилляры рядом с инструментом, чтобы иметь легкий доступ к капиллярной загрузочной модулю.
    2. Возьмите один капилляр, удерживайте его на одном конце и коснитесь раствора в белковой пластине с дальним концом капилляра, чтобы передать образец капиллярным действием. Всегда надевайте перчатки и не прикасайтесь к капилляру посередине, так как примеси(например,частицы пыли) из перчаток повлияют на измерение.
    3. Поместите капилляр в назначенное положение держателя, убедившись, что он правильно выровнен и центрирован.
    4. Повторите шаги 3.3.2 и 3.3.3, тем самым заполнив все позиции в загрузочном модуле. Загрузите все капилляры, которые вам понадобятся для измерения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: За один прогоно можно загрузить не более 48 капилляров.
    5. В конце поместите магнитную полосу поверх капилляров, чтобы удержать их на месте, и нажмите Close Drawer, чтобы начать эксперимент.
  4. Проведение эксперимента с нано-DSF
    1. Флуоресцентное сканирование
      1. Откройте приложение Prometheus PR. ThermControlи создайте новый проект, щелкнув Начать новый сеанс, используя имя ProteinName_ScreenName_PlateNumber. Во-первых, выполните сканирование Discovery, чтобы обнаружить флуоресценцию образцов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Уровни флуоресценции в идеале должны быть выше 3000 отсчетов для каждого образца. Образцы, имеющие флуоресценцию выше предела насыщения прибора (20 000 отсчетов), измеряться не будут.
      2. Изменяйте флуоресцентный сигнал образцов, регулируя мощность возбуждения лазера(рисунок 4).
    2. Термическая денатурация
      1. Перейдите на вкладку «Сканирование плавления». Для выполнения эксперимента установите начальную температуру на 20 °C, конечную температуру на 95 °C и температурный наклон на 1 °C мин-1. Нажмите начать измерение.
    3. Аннотирование эксперимента
      1. После начала экспериментов перейдите на вкладку Аннотация и результаты. Аннотировать каждый капилляр, придавая ему уникальный номер пластины и колодца.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Например, капилляр 1B2 будет соответствовать пластине 1 и скважине B2. В этой вкладке могут быть добавлены дополнительные столбцы для эксперимента, например,название белка, буфер, концентрация белка. После завершения эксперимента результаты также отображаются на этой вкладке. Это хорошее время, чтобы сделать паузу в конце дня; эксперименты проходят ночью, результаты могут быть собраны на следующий день.
    4. Визуализация и экспорт данных
      1. После завершения эксперимента перейдите на вкладку Melting Scan (Сканирование плавления), чтобы просмотреть кривые плавления и рассеяния образцов. Чтобы экспортировать результаты в электронную таблицу, перейдите на вкладку Melting Scan, нажмите «Экспорт»и выберите «Экспорт обработанных данных» в раскрывающемся меню.

figure-protocol-4
Рисунок 4:Регулировка мощности возбуждения и сигнала флуоресценции. (A) При 80% мощности возбуждения сигнал флуоресценции для большинства образцов выходит за пределы насыщения. (B)Флуоресцентный сигнал уменьшается до измеримых уровней путем уменьшения мощности возбуждения до 60%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Итерация

  1. Повторите шаги 1–3, чтобы выполнить 16 запусков всей библиотеки Enamine, насыляемой 768 соединениями (16 × 48 = 768).
  2. Поскольку измерение каждой пластины занимает ~ 1,5 ч, заполните аннотацию (3.4.3) и подготовьте следующую пластину с фрагментами белка, повторив шаги в разделах 1 и 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В типичный рабочий день можно измерить 4-6 пластин, в зависимости от опыта. Скрининг всей DSi-библиотеки может быть завершен в общей сложности за 3-4 дня.

5. Анализ данных

  1. Изучение сгенерированных данных
    1. После завершения каждого запуска перейдите на вкладку Аннотации и результаты, чтобы отобразить результаты. Для каждого образца сосредоточьтесь на двух рассчитанных значениях, которые наиболее важны в этом обзоре: 1) Температура начала рассеяния(Onset #1 для Scattering),которая указывает на температуру в начале событий рассеяния увеличенного образца и характерна для агрегации; 2) значение Tm (точка перегиба #1 для ratio),извлеченное из соотношения между событиями флуоресценции при значениях 330 и 350 нм, которые обычно соответствуют максимальным изменениям флуоресценции триптофана при изменениях в его среде.
    2. Обязательно проверьте кривые рассеяния и плавления для каждого капилляра на вкладке Melting Scan, чтобы убедиться, что эти значения надежны.
  2. Экспорт и проверка в электронную таблицу
    1. Экспортируйте данные из всех различных запусков для проверки в программное обеспечение для работы с электронными таблицами, как описано в 3.4.4, и создайте обзорные таблицы и графики. Нажмите на различные листы в файле электронной таблицы, чтобы отметить информацию в каждом листе.
      1. Обратите внимание, что на листе Обзор каждая строка соответствует одному эксперименту. Вдоль обзора параметров(например,начальная и конечная температура) наблюдайте рассчитанные значения для Tm и начала рассеяния (см. 5.1 выше для имен и объяснений и дополнительные файлы 1 и 2 для примера). Поскольку программное обеспечение вычисляет два или болеезначений T m (точка перегиба # 1 и # 2 для ratio) для некоторых образцов, посмотрите на кривую перехода плавления, чтобы определить, какое иззначений T m является правильным.
      2. На листе Соотношение обратите внимание, что каждый столбец соответствует образцу, а каждая строка — данным, считываемым на каждом уровне температуры. Наблюдайте за значениями количества флуоресценций, соответствующими каждому температурной ступени, и используйте их для построения кривых плавления для конкретных образцов, отображая столбец температуры против столбца подсчета флуоресценции. Отметим, что данные в Ratio (первая производная), 330 нм, 330 нм (первая производная), 350 нм, 350 нм (первая производная) используются для расчета соотношения и его первой производной (которая имеет максимум при максимальной скорости изменения) в аналогичном формате.
      3. Наблюдайте аналогичные данные для рассеяния в листе Scattering. Создайте кривую рассеяния для каждого образца, построив столбец температуры на фоне столбца рассеяния. Найдите в Листе первую производную рассеяния.
  3. Создание и проверка глобального обзора для всех фрагментов
    1. После проверки правильныхзначений T m для фрагментов объедините столбцы Sample ID и Inflection point с соотношением 330/350 нм (Tm)из всех запусков в один новый результирующий файл, копируя эти столбцы из каждого запуска.
    2. Используйте среднее значение Tm нативного белка (обычно вычисляемое за десять прогонов) и вычтите его из значений Tm каждого образца, чтобы получить ΔTm. Отсортируйте результаты по ΔTm в порядке убывания, чтобы определить образцы, которые приводят к наибольшему сдвигу.
    3. Разделите фрагменты на бункеры в зависимости от сдвига ΔTm и сгенерируйте таблицу частот для всей библиотеки, построив ΔTm для каждого бункера против количества фрагментов(рисунок 5). Для удобства покажите ось, представляющую количество фрагментов в шкале журнала. Забинтуйте образец спомощью ΔT m ±1 и адаптируйте другие бункеры к каждому прогону, чтобы эмпирически отрегулировать количество выбросов.

Результаты

Полный экран библиотеки DSi-Poised (768 фрагментов) был выполнен на трех белках, представляющих медицинский интерес, а именно на внешней кинетохоре, высоко экспрессированной в раке 1 белка (Hec1 или Ndc80), регуляторном тетрарикопептидном повторе (TPR) монополярной веретениновой киназы 1 (Mps1) и SARS-CoV-2 3C-подобной протеазе Nsp5, которая расщепляет C-концерн реплики полипротеина на 11 участках. Буферные условия, выбранные для каждого белка, а также концентрация белка и Tm белков приведены в дополнительной таблице S4.

figure-results-1
Рисунок 5:Частотное распределение сдвига температуры плавления (ΔTm)для трех белков, Hec1, Mps1 и Nsp5, представленных в этом исследовании в качестве репрезентативных результатов. Сокращения: Hec1 = высоко экспрессированный в Раке 1 белок; Mps1 = монополярная веретениная киназа 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-подобная протеаза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты трех скринингов с использованием протокола, описанного выше, отображаемые в виде частотного распределения изменения Tm по отношению к числу фрагментов, показаны на рисунке 5. Эти графики были сгенерированы, как описано в разделе 5.3 протокола, в которых строится графика частоты наблюдаемого изменения Tm. Значение сдвига должно быть определено субъективным образом для каждого другого проекта, как описано в разделе обсуждения ниже. Отрицательные значения указывают на снижение температуры плавления в присутствии фрагмента, положительное значение – на увеличениеТм. м. Из таких сюжетов нетрудно заметить, что для Nsp5 все фрагменты оказывают дестабилизирующее действие, тогда как для Hec1 и Mps1 наблюдаются как стабилизирующие, так и дестабилизирующие удары. Этого можно ожидать и будет обсуждаться.

Обсуждение

Этот протокол описывает метод средней и высокой пропускной способности для скрининга библиотек фрагментов с использованием некоторых распространенных робототехнических и измерительных приборов. Экраны, подобные описанным в этом протоколе, могут регулярно выполняться NKI Protein Facility в Амстердаме, например, в качестве службы iNEXT-Discovery, часто даже бесплатно для пользователей после подачи заявки и экспертной оценки. В таких случаях библиотека DSi-Poised может быть предоставлена средством, но использование других библиотек также может обсуждаться в контексте каждого отдельного пользовательского приложения и соглашения об обслуживании. Выбор инструментов в этом протоколе представляет собой практические решения для многих лабораторий, но не должен рассматриваться как золотой стандарт. Для измерения термической стабильности белка-мишени для скрининга фрагментов рекомендуются методы без маркировки, а не методы, использующие экологически чувствительные этикетки для обнаружения разворачивания в термоциклере полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

Методы без этикеток, такие как представленный здесь с использованием инструмента «Прометей», имеют некоторые преимущества: они используют низкое количество белка, часто на пару порядков меньше; они могут использоваться для одновременного измерения рассеяния образца и, таким образом, агрегации; и метки, используемые для обнаружения разворачивания в других подходах, могут по-разному взаимодействовать с каждым фрагментом, что приводит к артефактам измерения. Этот протокол был описан в контексте робота Mosquito, который позволяет пипетку очень маленького объема образца (0,3 мкл), что невозможно сделать вручную. Комар — популярный робот, присутствующий во многих лабораториях, работающих над проектами по структурной биологии и открытию лекарств; однако в протоколе могут быть четко предусмотрены альтернативные подходы к малообъемной пипетче.

Библиотеки фрагментов содержат соединения, растворенные в ДМСО. Одной из первоначальных задач является поиск оптимальной концентрации ДМСО, при которой белок остается стабильным, а соединения остаются растворимыми. Это включает в себя выполнение измерений при различных концентрациях DMSO для определения оптимальных условий для скрининга. Используемое здесь разбавление белка в фрагмент приводит к концентрации ДМСО 0,2%; большинство белков достаточно стабильны в этих условиях. Количество белка, необходимое для проведения скрининга для библиотеки 768 соединений, составляет ~ 2-3 мг в общей сложности, так как измерения обычно проводятся при низких концентрациях белка (0,2 мг мл-1). Работа с такими относительно низкими концентрациями белка не только снижает затраты на производство белка, но и снижает шансы осаждения белка. Низкая концентрация белка не влияет на обнаружение связывания фрагментов, так как концентрация фрагментов в эксперименте составляет ~2 мМ, что позволяет идентифицировать и слабые связующие.

Поскольку обнаружение перехода плавления в этих экспериментах основано на интенсивности флуоресценции, критическим аспектом является определение мощности возбуждения лазера, при которой необходимо проводить измерения. Взаимодействие соединений с белком может (i) не влиять на его внутреннюю флуоресценцию, (ii) приводить к гашению или (iii) увеличивать его внутреннюю флуоресценцию. В дополнение к этому, работа с низкими концентрациями белка означает, что количество флуоресценций для нативного белка будет низким. Поэтому мощность возбуждения должна быть отрегулирована таким образом, чтобы можно было измерить большинство образцов. Профиль рассеяния каждого прогока предоставляет важную информацию об эффектах агрегирования, которые могут быть вызваны добавлением любого фрагмента. Кроме того, влияние температуры на растворимость соединения также можно увидеть на профиле рассеяния.

Неожиданно для многих соединений было замечено, что рассеяние фактически уменьшалось с повышением температуры(рисунок 6). Поэтому важно смотреть как на кривую перехода плавления, так и на сопутствующий профиль рассеяния, чтобы принять решение о надежности каждого эксперимента, особенно для тех фрагментов, которые считаются кандидатами на более требовательные измерения с помощью рентгеновской кристаллографии или ЯМР-спектроскопии или даже рассматриваются как хиты для последующей химии. Одним из специфических ограничений метода для целей скрининга фрагментов является то, что многие фрагменты в библиотеке DSi-Poised имеют значительную внутреннюю флуоресценцию, иногда даже за пределами предела насыщения детектора, и поэтому они не могут быть должным образом экранированы для связывания мишеней даже при низкой мощности возбуждения. Еще один момент, который следует отметить для этого метода, заключается в том, что он может использоваться только с белками, содержащими остатки триптофана.

figure-discussion-1
Рисунок 6:Влияние температуры на растворимость соединения. Кривая перехода плавления и профиль рассеяния Hec1 с двумя различными соединениями. (А)Профиль рассеяния показывает, что для этого образца температура не зависит от растворимости. (B)Профиль рассеяния показывает, что растворимость этого образца увеличивается с повышением температуры. Поэтому кривая перехода плавления в этом случае ненадежна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Открытым вопросом является то, что следует рассматривать как существенное изменениеТ-мне с математической точки зрения, а с практической точки зрения: какое изменениеТ-м важно рассматривать как показатель связывания лиганда с белком? В этих примерах сдвиги менее 1 °C наблюдаются для 74% фрагментов для связывания Hec1, 66% для Mps1 и 53% для Nsp5. Рассмотрение 1 °C как «значительного изменения» вряд ли даст удары, которые достойны дальнейшей химии. В обзорных графиках(рисунок 5)рассматривались бункеры сосдвигом 1, 2, 5 или более 5 градусов Т-м, как положительные, так и отрицательные. Это требует модификации в соответствии с каждым конкретным случаем, чтобы дать хороший обзор и позволить принимать обоснованные решения, определяя следующий шаг. Примечательно, что для некоторых белков наблюдалась как стабилизация, так и дестабилизация мишени в зависимости от рассматриваемых фрагментов. Оба события интересны, так как оба могут быть результатом связывания фрагментов, и оба могут привести к хорошей последующей молекуле для манипулирования поведением белка.

Остается последний вопрос, а именно: «Что определяет полезный хит?». На самом деле ответ зависит от конкретной ситуации. Например, для Hec1 все фрагменты, которые стабилизируют белок более чем на 2 градуса или дестабилизируют его более чем на 5, были переданы нашим сотрудникам-химикам, которые разработали новые молекулы на основе этих ударов. Для Nsp5, однако, наиболее дестабилизирующими ударами были сообщены нашим сотрудникам по ЯМР для подтверждения попаданий, полученных из nanoDSF, с помощью экспериментов ЯМР. Другими словами, результаты скрининга, полученные из этого протокола, должны анализироваться с осторожностью и в зависимости от контекста, принимая обоснованные решения на основе конкретного вопроса и окружающей методологии. В любом случае, метод, описанный здесь, является дополнительным подходом к существующим методологиям, таким как рентген и скрининг на основе ЯМР, которые могут быть направлены на подтверждение, приоритизации или предоставление новых идей для химических кампаний.

Дополнительная таблица S1: Список буферов, используемых для скрининга белков. Сокращения: HEPES = 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота; DTT = дитиотрейтол; MOBS = 4-(N-морфолино)бутансульфоновая кислота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица S2: Свойства пластины MRC 2-well для использования с роботом-нанодипенсером. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица S3: Свойства 96-скважинной V-донной пластины для использования с роботом-нанодипенсером. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица S4: Буфер, концентрация белка иТ-м белков, обсуждаемых в репрезентативных результатах. Сокращения: DTT = дитиотрейтол; Hec1 = высоко экспрессированный в раке белок 1; Mps1 = монополярная веретениная киназа 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-подобная протеаза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Обзор параметров-пример данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: значения Tm и ΔTm для 406 фрагментов - пример данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Раскрытие информации

Раскрытия информации нет.

Благодарности

«Эта работа выиграла от доступа к NKI Protein Facility, центру Instruct-ERIC. Финансовую поддержку оказали iNEXT, проект No 653706, и iNEXT-Discovery, проект No 871037, финансируемый программой Horizon 2020 Европейской комиссии».

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ClearVue SheetsMolecular Dimensionsклейкая герметизирующая пленка для белковой пластины
CORNING 6570 Алюминиевая герметизирующая лентаCORNINGклейкая герметизирующая пленка для фрагментной пластины
DSi уравновешенная библиотекаEnamineFragment библиотека, содержащая 768 соединений, использованных в этом исследовании
Elisa Reagent ReserviorThermoFisher Scientific15075Реагентный резерв используется для пипетирования белка
Грейнера круглых (U) донных пластинКат. No.  650201Фрагменты поставляются в этих пластинах
Mosquito тип X1sptlabtechPart nr- 3019-0003Нанолитровый дозатор
MRC 2-луночная кристаллизационная пластинаMRC96T-PS
Pierce ELISA Резервуары с реагентамиPierce
Prometheus Высокочувствительные капиллярыКаталог PR-C006
Prometheus NT.48 nanoDSFNanotemperКаталог No PR001 (+ Агрегационная детекционная оптика, каталог No PR-AGO)nanoDSF и обратное рассеяние света
Prometheus Стандартный капиллярный типКаталог PR-C002
TX-1000Термонаучнаяцентрифуга для пластин

Ссылки

  1. Hoffer, L., Muller, C., Roche, P., Morelli, X. Chemistry-driven hit-to-lead optimization guided by structure-based approaches. Molecular Informatics. 37 (9-10), 1800059(2018).
  2. Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
  3. Ress, D. C., Congreve, M., Murray, C. W., Carr, R. Fragment-based lead discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 660-672 (2004).
  4. Carr, R. A. E., Congreve, M., Murray, C. W., Rees, D. C. Fragment-based lead discovery: Leads by design. Drug Discovery Today. 10 (14), 987-992 (2005).
  5. Bradley, A. R., et al. The SGC beyond structural genomics: Redefining the role of 3D structures by coupling genomic stratification with fragment-based discovery. Essays in Biochemistry. 61 (5), 495-503 (2017).
  6. Davies, T. G., Tickle, I. J. Fragment screening using X-ray crystallography. Topics in Current Chemistry. 317, 33-59 (2012).
  7. Ma, R., Wang, P., Wu, J., Ruan, K. Process of fragment-based lead discovery - A perspective from NMR. Molecules. 21 (7), 854(2016).
  8. Troelsen, N. S., Clausen, M. H. Library design strategies to accelerate fragment-based drug discovery. Chemistry. 26 (50), 11391-11403 (2020).
  9. Shi, Y., von Itzstein, M. How size matters: Diversity for fragment library design. Molecules. 24 (15), 2838(2019).
  10. Taylor, A., Doak, B. C., Scanlon, M. J. Design of a fragment-screening library. Methods in Enzymology. 610, 97-115 (2018).
  11. Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).
  12. Sreeramulu, S., et al. NMR quality control of fragment libraries for screening. Journal of Biomolecular NMR. 74 (10-11), 555-563 (2020).
  13. Pfaff, S. J., Chimenti, M. S., Kelly, M. J. S., Arkin, M. R. Biophysical methods for identifying fragment-based inhibitors of protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1278, 587-613 (2015).
  14. Fattori, D., Squarcia, A., Bartoli, S. Fragment-based approach to drug lead discovery: Overview and advances in various techniques. Drugs in R & D. 9 (4), 217-227 (2008).
  15. Winter, A., et al. Biophysical and computational fragment-based approaches to targeting protein-protein interactions: Applications in structure-guided drug discovery. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (4), 383-426 (2012).
  16. Boelens, R., et al. iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
  17. Zhang, R., Monsma, F. Fluorescence-based thermal shift assays. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 13 (4), 389-402 (2010).
  18. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).
  19. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  20. Bruce, D., Cardew, E., Freitag-Pohl, S., Pohl, E. How to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the Virus-X Project. Journal of Visualized Experiments JoVE. (144), e58666(2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи