Высокопроизводительный анализ in vitro с использованием органоидов опухолей, полученных от пациента

Линии раковых клеток человека широко распространены для изучения биологии рака и оценки противоопухолевых агентов. Однако эти клеточные линии не обязательно сохраняют первоначальные характеристики своей исходной ткани, поскольку их морфология, мутация генов и профиль экспрессии генов могут изменяться во время культивирования в течение длительных периодов времени. Кроме того, большинство из этих клеточных линий культивируются в монослое или используются в качестве мышиных ксенотрансплантатов, ни один из которых физически не представляет собой опухолевую ткань^1,2. Таким образом, клиническая эффективность противоопухолевых средств может быть не такой же, как наблюдаемая в линиях раковых клеток. Поэтому были разработаны системы in vitro, такие как анализы ex vivo с использованием ксенотрансплантатов опухолей, полученных от пациента, или опухолевых органоидов (PDO) и моделей сфероидов опухолей, которые точно воспроизводят структуру и функцию опухолевых тканей. Все больше данных свидетельствуют о том, что эти модели предсказывают реакцию пациентов на противоопухолевые агенты, будучи непосредственно сопоставимыми с соответствующей раковой тканью. Эти системы in vitro были созданы для различных типов опухолевой ткани, и связанные с ними высокопроизводительные системы анализа (HTS) для скрининга лекарств также были разработаны^3,4,5,6,7. Гетерогенные органоидные культуры ex vivo первичных опухолей, полученные от пациентов или полученных от пациента опухолевых ксенотрансплантатов, приобрели значительную популярность в последние годы из-за их простоты культивирования и способности поддерживать сложность клеток в стромальной^{ткани 8,9,10.} Ожидается, что эти модели улучшат понимание биологии рака и облегчат оценку эффективности препарата in vitro.

Серия новых PDO была недавно создана из различных типов опухолевой ткани, обозначенных как F-PDO, в рамках проекта трансляционных исследований Фукусимы. PDO образуют большие клеточные кластеры с морфологией, аналогичной морфологии исходной опухоли, и могут культивироваться в течение более шести месяцев^11. Сравнительная гистология и всесторонний анализ экспрессии генов показали, что особенности PDO близки к особенностям их исходных опухолевых тканей даже после длительного роста в условиях культивирования. Кроме того, для каждого типа ПДО в 96-луночных и 384-луночных плитах был создан подходящий HTS. Эти анализы использовались для оценки нескольких молекулярных целевых агентов и антител. Здесь стандартные химиотерапевтические средства (паклитаксел и карбоплатин), используемые для лечения рака эндометрия, оценивались с использованием F-PDO, полученных от пациентки, которая не реагировала на паклитаксел и карбоплатин. Соответственно, ингибирующая рост клеток активность паклитаксела и карбоплатина в отношении этого ПДО была слабой (IC₅₀: >10 мкМ). Кроме того, в предыдущих исследованиях сообщалось, что чувствительность некоторых F-PDO к химиотерапевтическим агентам и молекулярным таргетным агентам согласуется с клинической эффективностью^11,12,13. Наконец, изменения в структуре PDO более высокого порядка, вызванные противоопухолевыми агентами, были проанализированы с использованием трехмерной системы анализа клеток^12,13. Результаты оценки противоопухолевых средств с использованием HTS на основе PDO сопоставимы с клиническими результатами, полученными для этих агентов. Здесь представлен протокол для более простой и точной HTS, который может быть использован для оценки эффективности противоопухолевых агентов и иммунотерапии с использованием моделей PDO.

Все эксперименты с использованием материалов человеческого происхождения были проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией и заранее одобрены комитетом по этике Медицинского университета Фукусимы (номера одобрения 1953 и 2192; даты утверждения 18 марта 2020 года и 26 мая 2016 года соответственно). Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов, которые предоставили клинические образцы, использованные в этом исследовании.

1. Культура ПДО

ПРИМЕЧАНИЕ: F-PDO образуют клеточные кластеры, которые демонстрируют различные гетерогенные морфологии и растут в культуре суспензии(рисунок 1). Кроме того, F-PDO можно культивировать более 6 месяцев и криоконсервировать для будущего использования.

1. Размораживание хранящихся PDO (день 0)
   1. Оттаивание и посевные PDO (например, RLUN007, аденокарцинома легких) на 0 день(рисунок 1). Во-первых, добавьте 15 мл среды для PDO (см. Таблицу материалов),содержащей 1% добавки B-27 и 30 нг/мл эпидермального фактора роста, в стерильную 50 мл центрифужную трубку.
   2. После извлечения замороженного флакона из хранилища жидкого азота осторожно перемешайте PDO на водяной бане с температурой 37 °C в течение 2 минут. Затем достаньте флакон с водяной бани, протрите флакон 70% этанолом, а затем переместите флакон в шкаф биологической безопасности.
   3. Перенесите содержимое флакона в пробирку, содержащую 15 мл среды для ПДО. Смешайте PDO и среду, аккуратно пипетируя вверх и вниз пять раз с помощью передаточной пипетки объемом 3 мл. Центрифугируйте трубку при 200 х г в течение 3 мин при ~25 °C и выбросьте супернатант. Повторно суспендировать гранулу PDO в 5 мл свежей среды и переложить в колбу размером 25^см2 (см. Таблицу материалов)с щадящим пипетированием. Наконец, культивируйте PDO в инкубаторе при 37 °C в 5% CO_2.
2. Меняйте среду два раза в неделю (дни 3-7). Центрифугировать суспензию PDO для осаждения клеточных кластеров и заменить 4 мл среды (80% объема). Повторно суспендировать клетки в свежей среде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство RLUN007 выглядят в виде клеточных кластеров диаметром 100-500 мкм. Когда цвет фенол-красного в среде изменится на желтый, как показано на рисунке 1А,заменяйте среду чаще. Если среда желтеет на следующий день после замены, и каждый кластер клеток сливается, образуя более крупные кластеры диаметром >500 мкм, проход с разделенным соотношением 1:2.
3. Субкультура (дни 8-28) ПДО
   ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая сложность фактического измерения количества одиночных ячеек, время прохождения определяется на основе соответствующей плотности кластера клеток и размера гранулы PDO после центрифугирования(рисунок 1B). В случае RLUN007 объем гранулы PDO достигает 30 мкл (насыщенная плотность в 25^см2 колбах) примерно через 2 недели после оттаивания.
   1. Для переноса из одной колбы 25^см2 в две колбы 25^см2 (P1) переложите суспензию PDO в центрифужную трубку и центрифугу при 200 х г в течение 2 мин при приблизительно 25 °C. Оцените объем гранулы PDO и выбросьте супернатант. Повторное суспендирование гранулы PDO с использованием пипетки 5 мл в 5 мл свежей среды. Пипетка осторожно поднимается и опускается пять раз на низкой скорости. Затем переложите половину объема суспензии PDO (2,5 мл) в две колбы и добавьте 2,5 мл свежей среды в каждую колбу. Культивируйте клетки при 37 °C в 5% CO_2.
   2. Для переноса из двух колб размером^{25 см2} в одну колбу размером 75^см2 (P2) переложите суспензию PDO из двух колб в две центрифужные трубки и центрифугируйте PDO при 200 x g в течение 2 мин при приблизительно 25 °C. Далее оценивают объем гранулы ПДО и повторно суспендируют гранулу в 2,5 мл свежей среды (на пробирку). После этого смешайте суспензию PDO в одной пробирке с суспензией в другой и переложите ее в колбу размером^{75 см2,} содержащую 10 мл свежей среды. Культивируйте клетки при 37 °C в 5% CO_2. Перенесите субкультируемые PDO из двух колб^{размером 25 см2} в одну колбу размером^{75 см2} примерно через 1 неделю после первого прохода(рисунок 1C).

2. Ингибирование роста HTS

ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибирующая рост активность противоопухолевых агентов в отношении ФДО оценивается путем измерения внутриклеточного содержания АТФ, как показано на фиг.2. Этот этап выполняется с использованием коммерчески доступного набора для анализа жизнеспособности клеток (см. Таблицу материалов).

1. На 0-й день культивируйте PDO (например, RLUN007) в колбах до тех пор, пока для анализа не будет доступно достаточное количество клеточных кластеров. За день до посева перенесите суспензию PDO из колбы^{75 см2} в трубку 15 мл и центрифугу при 200 х г в течение 2 мин для измерения объема гранул PDO. Затем повторно суспендируйте гранулу PDO в 15 мл свежей среды и переложите ее обратно в колбу размером^{75 см2.} Культивируйте клетки при 37 °C в 5% CO_2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемый объем гранул PDO зависит от скорости разбавления каждого PDO и количества 384-луночных пластин, используемых для анализа. Для RLUN007 для посева в десять пластин с 384 скважинами необходимо 200 мкл объема гранул.
2. На 1-й день (24 ч после смены среды) измельчите PDO с помощью оборудования для фрагментации и диспергирования ячеек (см. Таблицу материалов)с фильтродержателем, содержащим сетчатый фильтр 70 мкм. Затем разбавьте 15 мл суспензии PDO в 10 раз. Засейте 40 мкл суспензии PDO в 384-луночные сверхнизкие сфероидные (круглодонные) микропластины (см. Таблицу материалов)с помощью дозатора клеточной суспензии (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для измельчения клеточных кластеров рекомендуется использовать коммерчески доступное оборудование для фрагментации и дисперсии ячеек (см. Таблицу материалов).
3. Через 24 ч после посева (день 2) обработать ПДО 0,04 мкл растворов испытуемого агента в конечных диапазонах концентраций от 20 мкМ до 1,0 нМ (10 последовательных разведений) с помощью жидкого обработчика (см. Таблицу материалов).
4. На 8-й день (144 ч после обработки исследуемым веществом) добавляют внутриклеточный реагент для измерения АТФ в исследуемые скважины. Перемешайте пластины с помощью миксера и инкубируйте в течение 10 мин при 25 °C. Измерьте внутриклеточное содержание АТФ в виде люминесценции с помощью пластинчатого считывателя (см. Таблицу материалов).
5. Для расчета жизнеспособности ячейки разделите количество АТФ в испытательных скважинах на количество в контрольных скважинах, содержащих транспортное средство, с вычитанием фона. Для расчета темпов роста в течение 6 дней разделите количество СПС в контрольных колодцах транспортного средства на количество сПС в контрольных колодцах транспортного средства через 24 ч после посева.
6. Рассчитать значения 50% ингибирующей концентрации (IC₅₀₎и площади под кривой (AUC) из кривых доза-реакция с использованием программного обеспечения для анализа биологических данных (см. Таблицу материалов). Z-фактор является безразмерным параметром, который колеблется от 1 (бесконечное разделение) до <0, определяемый как Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, где σc+, σc-, μc+ и μc- являются стандартными отклонениями (σ) и средними (μ) высоких (c+) и низких (c−) контролей¹⁴соответственно.

3. HTS с системой отбора и визуализации клеток для ингибирования роста

ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии большого отклонения (когда коэффициент вариации [CV] при анализе составляет более 20%) в данных с использованием протокола 2, PDO выбранного размера могут быть засеяны в 96-луночные или 384-луночные пластины с использованием системы отбора и визуализации клеток(фиг.2). Протокол аналогичен описанному в шагах 2.1 и 2.2 предыдущего раздела. Этот этап выполняется с использованием коммерчески доступной системы отбора и визуализации клеток (см. Таблицу материалов).

1. На 1-й день установите 384-луночную сверхнизкую сфероидную микропластину с 40 мкл среды/колодца в качестве целевой пластины на системе отбора и визуализации ячеек.
2. Заполните камеру сбора (см. Таблицу материалов)6 мл питательной среды и центрифугой при 1 500 х г в течение 2 мин для удаления пузырьков воздуха. Добавьте PDO, взвешенные в среде (объем гранул PDO, 4 мкл), в камеру отбора и установите на систему.
3. Выдерживают камеру не менее 1 минуты с последующим диспергированием, чтобы кластеры клеток осели на дне камеры; затем выполните сканирование камеры.
4. Установите размер подбора 140-160 мкм (площадь 15,386-20,000^мкм2)на системе автоматического отбора кластеров ячеек. Затем проверьте качество выбранных кластеров клеток на отсканированных изображениях и перенесите десять кластеров клеток на скважину с помощью подсказок по подбору (см. Таблица материалов)в целевую пластину.
5. Выполните шаги протокола, начиная с шага 2.3.

4. HTS для антителозависимой клеточной цитотоксичности

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется с использованием коммерчески доступной системы (см. Таблицу материалов),которая представляет собой прибор для измерения электрического импеданса. Он используется для оценки цитолиза PDO по антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) с моноклональными антителами и естественными клетками-киллерами (NK)(рисунок 3). NK-клетки получают из мононуклеарных клеток периферической крови с использованием набора для производства NK-клеток (см. Таблицу материалов)в соответствии с инструкциями производителя.

1. Измерение активности ADCC
   1. На 0-й день покрыть 96-луночную пластину (см. Таблицу материалов)50 мкл раствора фибронектина 10 мкг/мл (0,5 мкг/лунка) при 4 °C в течение ночи.
   2. На 1-й день, после удаления раствора фибронектина, добавляют 50 мкл культуральной среды в каждую лунку для измерения фонового импеданса.
   3. Перед посевом добавляют 5 мл реагента диссоциации клеточной культуры (см. Таблицу материалов)в PDO (RLUN007: 100 мкл гранулы PDO в колбе 75 см²⁾ и инкубируют в инкубаторе_CO2 при 37 °C в течение 20 мин для диспергирования PDO. Чтобы остановить трипсинизацию, добавляют 5 мл среды, центрифугу и удаляют диссоциационный реагент. Промыть PDO свежей средой и процедить через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм (см. Таблицу материалов).
   4. Подсчитайте количество ячеек с помощью анализатора жизнеспособности клеток (см. Таблицу материалов).
   5. Переложите суспензию PDO в резервуар и перемешайте с помощью многоканального пипетка. Добавьте суспензию PDO в скважины с ячейками 5 x^{10 4} ячейками/лункой в 96-луночной пластине. Каждая скважина содержит конечный объем 100 мкл. Затем поместите пластину в шкаф биологической безопасности при температуре приблизительно 25 °C в течение 30 мин.
   6. Перенесите пластину на инструмент в инкубаторе CO₂ при 37 °C. Записывайте изменения сигналов импеданса каждые 15 минут в качестве индекса ячейки.
   7. Разморозьте NK-клетки на водяной бане с температурой 37 °C в тот же день, что и посев PDO. Перенос клеток из флакона в трубку объемом 15 мл, содержащую 10 мл среды для NK-клеток (см. Таблицу материалов)и центрифугу при 300 х г в течение 5 мин при приблизительно 25 °C. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки в 10 мл свежей среды. После подсчета клеток отрегулируйте плотность ячейки до 1 x^{10 6} клеток/мл и перенесите в колбу размером^{75 см2.} Культивируйте NK-клетки в инкубаторе 5% CO₂ при 37 °C.
   8. На 2-й день готовят растворы антител (фосфатно-буферный физиологический раствор) в 10-кратной конечной концентрации в стерильных V-образных 96-луночных пластинах.
   9. Удалите 60 мкл среды из каждой лунки и добавьте 10 мкл трастузумаба или раствора цетуксимаба (10 мкг/мл, 1 мкг/мл и 0,1 мкг/мл) к PDO. Переложите пластины обратно на прибор в инкубатор и запишите индекс ячейки в течение 1 ч.
   10. Переложите суспензию NK-ячейки в трубку объемом 50 мл и подсчитайте номер ячейки. Центрифугируйте ячейки при 300 x g в течение 5 мин и отрегулируйте плотность NK-клеток до 1 x^{10 6} ячеек/мл и 2 x^{10 6} ячеек/мл со средой для PDO.
   11. Добавьте 50 мкл суспензии NK-клеток к эффекторным (NK) клеткам при соотношении клеток-мишеней (RLUN007) 1:1 или 2:1. Конечные концентрации антител составляют 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл и 0,01 мкг/мл. Держите пластину при температуре приблизительно 25 °C в течение 15 минут и верните пластины к инструменту.
2. Сбор и анализ данных
   1. Преобразуйте индекс ячейки в процентные значения цитолиза с помощью аналитического программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
   2. Процент цитолиза относится к проценту клеток-мишеней, убитых NK-клетками, по сравнению с клетками-мишенями (PDO) только в качестве контроля. Вычтите клеточные индексы скважин, содержащих только NK-ячейки, из индекса пробных скважин в каждой точке времени. Нормализуйте каждое значение к клеточному индексу непосредственно перед добавлением антител. Преобразуйте нормализованный индекс клетки в процент цитолиза, используя следующее уравнение: % цитолиза = (1 - нормализованный индекс клеток [образцовые скважины]) / нормализованный индекс клеток (только целевые скважины) x 100.

Высокоточный HTS был разработан с использованием PDO и 384-луночных микропластин для оценки противоопухолевых агентов, а о разработке HTS для каждого PDO ранее сообщалось10,11,12,13. Производительность HTS оценивалась путем расчета CV и Z'-фактора. Z'-фактор является широко распространенным методом для проверки качества и производительности анализа, и анализ подходит для HTS, если это значение составляет >0,514. Контрольные исходные точки в 384-луночном пластинчатом анализе с использованием RLUN007 показали небольшую изменчивость, со значениями CV 5,8% и расчетными Z'-множителями 0,83, как показано на рисунке 4. Эти результаты показывают, что этот анализ имеет высокую производительность для HTS. Чтобы исследовать чувствительность PDO к противоопухолевым агентам с использованием HTS, ингибирование роста оценивали с использованием RLUN007, получавшего восемь противоопухолевых агентов, в частности, ингибиторы рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (афатиниб, эрлотиниб, гефитиниб, лапатиниб, осимертиниб и роцилетиниб) и паклитаксел, которые являются стандартными клиническими методами лечения немелкоклеточного рака легкого, и митомицин С в качестве положительного контроля. Значения IC50 и AUC противоопухолевых агентов для каждого PDO показаны на рисунке 4. RLUN007 показал высокую чувствительность (IC50 < 2 мкМ, AUC < 282) для всех ингибиторов EGFR и других противоопухолевых агентов. Сигмовидные кривые, рассчитанные для всех данных, показали, что ингибирующая рост активность противоопухолевых агентов может быть точно измерена.

Система отбора и визуализации клеток используется, когда данные значительно различаются с использованием вышеуказанной методологии. Система сбора и визуализации клеток, которая точно выбирает кластеры клеток, не повреждая их, позволяет проводить точные анализы HTS, выравнивая размер кластера клеток, чтобы исключить клеточный мусор из системы анализа. Когда система не использовалась, значение CV составляло 26,0%, а значение Z'-фактора — 0,23 (данные не показаны). Тем не менее, значения CV и Z'-фактора были улучшены на 6,4% и 0,81 соответственно с использованием системы.

Для исследования цитолиза PDO с активностью ADCC с использованием прибора измерения электрического импеданса, который контролирует количество, морфологию и прикрепление клеток в течение длительного времени, изменения сигналов импеданса оценивали с использованием RLUN007, обработанных антителами (трастузумаб и цетуксимаб) и NK-клетками в качестве эффекторных клеток в 96-луночной пластине. По сравнению с контролем, состоящим только из клеток-мишеней, процент цитолиза увеличивался со временем. Он достигал 45% или 75% через 6 ч при соотношении E:T 1:1(Рисунок 5A,C)или 2:1(Рисунок 5B,D)без антител. NK-клеточный цитолиз с использованием трастузумаба составлял приблизительно 60% и 90% в соотношении 1:1(Фиг.5А,1 мкг/мл) и 2:1(Фиг.5В,1 мкг/мл), соответственно, через 6 ч. Напротив, цетуксимаб оказывал дозозависимое влияние на NK-клеточный цитолиз (Рисунок 5C,D). При наибольшей концентрации цетуксимаба RLUN007 разрушали на 90% и 100% в соотношении 1:1 и 2:1 соответственно (Рисунок 5C,D). Эффект трастузумаба был слабее, чем у цетуксимаба, с цитотоксичностью всего 60%. Эти результаты показывают, что система анализа PDO может оценивать активность ADCC с использованием технологии на основе импеданса в режиме реального времени.

Рисунок 1:Критические точки для культуры PDO. (A) Изменение цвета в среде. (B)Измерение количества PDO от размера гранул путем прокладки центрифужной трубки, содержащей PDO, с трубками, маркированными на уровнях 50-200 мкл.(C)плотность PDO. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Краткое изложение протокола, используемого для создания высокопроизводительной системы анализа с использованием 384-луночных микропластин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Краткое изложение протокола для высокопроизводительного анализа активности ADCC. ADCC, антителозависимая клеточная цитотоксичность; НК, природный убийца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Высокопроизводительная система анализа для ингибирования роста противоопухолевыми средствами. Кривая доза-реакция RLUN007 на противоопухолевые средства. Измельченные PDO были посеяны в плиты из 384 скважин. Их лечили в течение 6 дней десятью различными концентрациями противоопухолевых агентов (от 10 мкМ до 1,5 нМ). Данные представляют собой среднее ± стандартного отклонения трехкратных экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5:Высокопроизводительный анализ активности ADCC. (А,Б) Трастузумаб. (C,D) Цетуксимаб. (А,С) Соотношение RLUN007 к эффекторным клеткам 1:1. (Б,Д) Цитолиз с соотношением RLUN007: эффекторные клетки 1:2. Активность измеряли через 12 ч после добавления эффекторных клеток. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения трех реплицированных образцов. ADCC, антителозависимая клеточная цитотоксичность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Fujifilm Wako Bio Solutions Corporation является дочерней компанией Fujifilm Wako Pure Chemicals, коммерческого владельца носителей F-PDO и F-PDO путем передачи лицензии.