Мы описываем подробный протокол генерации индуцированных человеком плюрипотентных органоидов мозга, полученных из стволовых клеток, и их использование в моделировании митохондриальных заболеваний.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генерация органоидов головного мозга человека для моделирования митохондриальных заболеваний
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Митохондриальные заболевания представляют собой самый большой класс врожденных ошибок метаболизма и в настоящее время неизлечимы. Эти заболевания вызывают дефекты развития нервной системы, основные механизмы которых еще предстоит выяснить. Основным препятствием является отсутствие эффективных моделей, повторяющих раннее нарушение нейронов, наблюдаемое у пациентов. Достижения в технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs) позволяют генерировать трехмерные (3D) органоиды мозга, которые могут быть использованы для исследования влияния заболеваний на развитие и организацию нервной системы. Исследователи, в том числе эти авторы, недавно представили органоиды человеческого мозга для моделирования митохондриальных расстройств. В этой статье сообщается о подробном протоколе для надежной генерации органоидов головного мозга человека, полученных из iPSC, и их использовании в митохондриальном биоэнергетическом профилировании и анализе изображений. Эти эксперименты позволят использовать органоиды мозга для исследования метаболических дисфункций и дисфункций развития и могут предоставить важную информацию для препарирования нейронной патологии митохондриальных заболеваний.
Введение
Митохондриальные заболевания представляют собой самый большой класс врожденных ошибок метаболизма1. Они вызваны генетическими мутациями, нарушающими различные митохондриальные процессы, включая окислительное фосфорилирование (OXPHOS)2, сборку дыхательной цепи, митохондриальную динамику и транскрипцию или репликацию митохондриальной ДНК3. Ткани с энергетическими потребностями особенно страдают от митохондриальной дисфункции4. Соответственно, у пациентов с митохондриальными заболеваниями обычно развиваются ранние неврологические проявления.
В насто....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование человеческих ИПСК может потребовать этического одобрения. IPSCs, используемые в этом исследовании, были получены от здоровых контрольных лиц после местного этического одобрения (#2019-681). Все процедуры культивирования клеток должны выполняться под стерильным клеточным культиватором, тщательно дезинфицируя все реагенты и расходные материалы перед переносом под капот. Человеческие ИПСК, используемые для дифференциации, должны иметь число проходов ниже 50, чтобы избежать потенциальных геномных аберраций, которые могут возникнуть при обширной культуре. Плюрипотентное состояние клеток должно быть подтверждено до генерации органоидов, например, п....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протокол, описанный здесь, облегчает надежную генерацию круглых органоидов (рисунок 1A). Генерируемые органоиды содержат зрелые нейроны, которые можно визуализировать с помощью белковых маркеров, специфичных для аксонов (SMI312) и дендритов (микротрубоче-ассоциированный белок 2 (MAP2)) (Рисунок 1B). Зрелые органоиды содержат не только нейронные клетки (MAP2-положительные), но и глиальные клетки (например, положи.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой статье описывается воспроизводимая генерация органоидов головного мозга человека, полученных из iPSC, и их использование для моделирования митохондриальных заболеваний. Протокол, описанный здесь, модифицирован на основе ранее опубликованной работы20. Одним из основных преимуществ настоящего протокола является то, что он не требует ручного встраивания каждого органоида в матрицу строительных лесов. По сути, матричный раствор просто растворяется в клеточной культуральной среде. Кроме того, не.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых или нефинансовых интересов.
Благодарности
Благодарим Мириам Бюннинг за техническую поддержку. Мы признаем поддержку со стороны Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 to A.P.), Spark и Берлинского института здравоохранения (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), Объединенного фонда митохондриальных заболеваний (UMDF) (грант Международного консорциума синдрома Ли для A.P.), Университетской больницы Дюссельдорфа (Forschungskommission UKD to A.P.) и Федерального министерства образования и исследований Германии (BMBF) (e: Грант био молодого исследователя AZ 031L0211 для A.P.). Работа в лаборатории C.R.R. была поддержана DFG (ЗА 2795 «Синапсы в состоянии стресса», Ro 2327/13-1).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2-меркаптоэтанол | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Программное обеспечение для верстки; Редактор векторной графики | |
| Alexa Fluor 488 осел анти-морская свинка | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 осел анти-мышь | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Антимицин А | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Анти-&бета;-тубулин III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Аргоновый лазер | Меллес Гриот | Любой другой лазер, например, диодные лазеры, излучающие 488, тоже | |
| Аскорбиновая кислота | Sigma | A92902 | |
| B-27 с витамином А | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% в PBS, хранить раствор при -20 °°; C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Клетка Звездная клеточная культура 6-луночный планшет | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Химически определенный липидный концентрат | Gibco | 11905031 | |
| Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп C1 | Микроскоп Nikon Решения | Модульный конфокальный микроскоп система | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Матрица базальной мембраны, фенол без красного, без LDEV | Corning | 356231 | Компонент матрицы |
| CyQUANT Набор для анализа пролиферации клеток | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO Sigma | D2660-100ML | ||
| Donkey Anti-goat Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Donkey anti-rabbit Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc фотоаппарат | Nikon Microscope Решения | ||
| Eclipse 90i вертикальный широкопольный микроскоп | Nikon Microscope Solutions | ||
| Вертикальный микроскоп Eclipse E 600FN | Решения для микроскопов Nikon Eclipse | ||
| Ts2 Инвертированный микроскоп | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Решения | Программное обеспечение для визуализации для конфокального микроскопа | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Сыворотка для плода крупного рогатого скота | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Стеклянный пипетка Пастера | Бренд | 747715 | инвертированный |
| глутамакс | Gibco | 35050-061 | |
| Гелий-неоновый лазер | Melles Griot | Любой второй лазер, например, диодные лазеры, излучающие 594 - это хорошо, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Программное обеспечение для обработки изображений | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Замена нокаутирующей сыворотки | Gibco | 10828010 | |
| лазер (407 нм) | Когерентный | Любой другой лазер, например, диодные лазеры, излучающие 407, тоже подойдут | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Технология стволовых клеток | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Набор для обнаружения микоплазмы | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Игла для одноразового использования (23G x 1" TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Программное обеспечение для обработки изображений | Nikon | |
| Олигомицин А | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Орбитальный шейкер Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma Z377821-1EA | Для рисования гидрофобного барьера на предметных стеклах. | |
| Набор системы диссоциации папаина | Worthington | LK003150 | |
| параформальдегида | Merck | 818715 | 4% в PBS, хранить раствор при -20 °° C |
| Пипетка Пастера 7mL | VWR | 612-1681 | Градуирована до 3 мл |
| Пенициллин-стрептомицин | Gibco | 15140-122 | |
| План Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Сухой микроскоп | |
| Объектив План Apo VC 60x / 1.40 масло DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Масляный иммерсионный микроскоп Объектив | |
| Чашка Петри из полистирола (100 мм) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Трубка из полистирола с круглым дном и крышкой из фильтра (5 мл) | Falcon | 352235 | |
| хлорид калия | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glass Antifade Moutant Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Качественная фильтровальная бумага | VWR | 516-0813 | |
| Ингибитор горных пород | Merck | SCM075 | |
| Rotenone | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Лезвия скальпеля | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Бикарбонат натрия | Merck/Sigma | 31437-1кг-M | |
| Хлорид натрия | Roth | 3957 | |
| Натрий дигидрофосфат | Апплименем | 131965 | |
| пируват натрия | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Реагент для диссоциации клеток | Gibco/StemPro | A1110501 | Реагент A |
| Super Glue Gel | UHU | 63261 | Адгезивный гель |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Шприц для одноразового использования (1 мл) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Капюшон | для культуры тканейThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Производство прекращено, любой другой регулируемый микротом тоже подойдет. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Sword | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt антагонист I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 анализатор внеклеточного потока | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seahorse Bioscience | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-луночный микропланшет) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
Ссылки
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080(2016).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
