Область структурной биологии превратилась в мощную систему понимания биологии через атомные детали биомолекулярных структур, обогащая наше понимание биохимических путей и молекулярной основы заболеваний, а также предлагая незаменимый инструмент для трансляционных исследований.
С годами структурная биология вышла далеко за рамки описания статических структур, она также сообщает о молекулярных взаимодействиях, как в растворе, так и в клетках, изучая временные масштабы и динамику. Можно получить информацию для объяснения процессов в разных масштабах размеров, а именно, от атомов и отдельных молекул до целых вирусных частиц и клеток. Различные технологии обеспечивают синергетический набор экспериментальных подходов, включая методы рассеяния на основе рентгеновских лучей, нейтронов или электронов, например, рентгеновскую кристаллографию (MX) или малоугловое рентгеновское рассеяние (SAXS); твердотельный и растворный ядерный магнитный резонанс (ЯМР); и реконструкция отдельных частиц с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ). Такие методы, как крио-ЭМ томография, крио-мягкая рентгеновская томография и внутриклеточный ЯМР, дополняют этот арсенал подходов к изучению высокомолекулярных систем, особенно в сочетании с другими инструментами визуализации. Вместе с дополнительными биофизическими методами, которые предоставляют дополнительную информацию о сродстве и временных масштабах молекулярного взаимодействия, интегративная структурная биология в настоящее время предлагает внушительный пакет для понимания жизни и разработки лекарств, биологических препаратов (антител, нанотел, вакцин), биоматериалов и других биологических агентов, таких как ферменты, которые могут быть использованы для разложения пластика и помощи окружающей среде.
С самого начала Европейская комиссия (ЕК) признала преимущества, которые исследования в области структурной биологии имеют для общества, и с 1980-х годов Европа активно инвестировала в бесплатное открытие дорогостоящего оборудования для структурной биологии для более широкого научного сообщества. Эта демократизация доступа к многомиллионным объектам стала движущей силой и краеугольным камнем для развития области структурной биологии на международном уровне. Это поставило Европу на передний край в этой области, тем самым способствуя сильному промышленному сектору и внося вклад в местную экономику.
ЕК бережно хранит давнюю и впечатляющую традицию доступа внешних исследователей и обучения в области технологий структурной биологии. Вслед за успешной программой iNEXT (Инфраструктура для ЯМР, ЭМ и рентгеновских исследований для трансляционных исследований), которая предоставила бесплатный доступ к высококлассным объектам и всем европейским исследователям в области структурной биологии до конца 2019 года, в феврале 2020 года стартовал проект Horizon2020 iNEXT-Discovery на еще один четырехлетний период полностью финансируемого доступа к инфраструктурам структурной биологии. В то же время, Instruct-ERIC является ориентиром Европейского стратегического форума по исследовательским инфраструктурам, представляя собой устойчивый оплот в структурной биологии для европейского и международного научного сообщества. Вместе они стремятся вовлечь медиков и других специалистов в исследования в области структурной биологии, и для этого они предлагают доступ к некоторым из лучших знаний, технологий и средств в области структурной биологии во всем мире, как исследователям из академических кругов, так и из промышленности. Вместе с дополнительными партнерами они также организуют семинары и практические тренинги.
Из-за пандемии Covid-19 поездки в исследовательские центры iNEXT-Discovery и Instruct-ERIC были в значительной степени затруднены, что по сути сделало невозможным практическое обучение. Чтобы частично компенсировать это, iNEXT-Discovery и Instruct-ERIC организовали серию вебинаров (https://inext-discovery.eu/events/what-can-inext-discovery-do-for-us, https://instruct-eric.eu/content/instructeric-webinar-series-structure-meets-function), а также специальный выпуск журнала Journal of Visualized Experiments. Здесь вы найдете подробное описание не только некоторых из наших основных процедур доступа, но и специализированных процедур, которые находятся в стадии разработки в области интегративной структурной биологии. Несмотря на то, что наши методы подробно описаны в этом выпуске, некоторые из них требуют специальных знаний и оборудования, которые трудно установить на месте. Установки Instruct-ERIC и iNEXT-Discovery доступны для предоставления этих методов, включая производство биомолекул, необходимых для структурных исследований, с помощью и под контролем высококвалифицированного местного персонала.
Усовершенствованные методы определения высокомолекулярных структур
За последнее десятилетие крио-ЭМ превратилась в очень популярную технологию для определения высокомолекулярных сложных структур. Команда из Университета Лидса (Великобритания) представляет обзор всех этапов, связанных с одночастичным электромагнитным анализом, уделяя особое внимание переменным, которые могут быть оптимизированы в ходе рабочего процесса, и устранениюраспространенных проблем. В связи с тем, что работа с онлайн-микроскопом внешними пользователями становится стандартом, требуются протоколы для эффективного удаленного управления и визуализации. С помощью анализа отдельных частиц остеклованные образцы визуализируются для создания видеороликов, показывающих частицы в случайной ориентации. Рабочий процесс обработки изображений определяет параметры для реконструкции исследуемого образца. Программное обеспечение Scipion от CSIC (ES) предоставляет все инструменты для создания этого рабочего процесса, а также обеспечивает прямую прослеживаемость результатов2.
Сбор данных рентгеновской дифракции на очень мелких кристаллических образцах открывает большие возможности для исследований, а также ставит перед ними технические задачи. Команда Diamond (Великобритания) представляет использование инструментов крио-ЭМ для получения сотен микрокристаллов на одной сетке с минимальным количеством окружающей жидкости на носителе с низким уровнем шума перед сбором данных в специальной среде пучка, которая включает вакуум в рентгеновском тракте до и после образца3. Последовательный сбор рентгеновских данных в синхротронах также является ключом к изучению других сложных кристаллических систем. В другом материале Даймонд показывает пошаговые инструкции, рисунки и видео по сбору данных с использованием различных систем доставки кристаллов с помощью серии примеров4.
Современная интегративная структурная биология в разработке лекарств
Рентгеновская кристаллография хорошо зарекомендовала себя для поиска лекарств на основе фрагментов и уже широко используется для идентификации попаданий, которые могут быть плавно развиты на ведущих кандидатов. Команды из Diamond5, Helmholtz-Zentrum Berlin (DE) и MAX IV (SE)6, а также подразделения EMBL в Гренобле (FR)7 рассказывают о своих последних разработках в области автоматизации рабочих процессов для эффективной кристаллизации мишеней, замачивания фрагментов, монтажа кристаллов, кристаллографического скрининга фрагментов и осаждения структур. Их конвейеры достаточно автоматизированы и используются внешними исследователями по всему миру. Они были применены к уже более чем 100 мишеням (часто удаленно) для выявления попаданий для дальнейшего проектирования сложных соединений и разработки свинцов с помощью структуры.
ЯМР также широко используется для скрининга фрагментов в кампаниях по разработке лекарств, нацеленных либо на белки, либо на полинуклеотиды, как растворимые, так и связанные с мембраной. Университет Гёте во Франкфурте (Германия) представляет оптимизированные конвейеры скрининга ЯМР, сокращающие ручное вмешательство во время экспериментов и анализов8. Их устройства смены образцов обрабатывают сотни образцов ЯМР за один прогон в течение нескольких дней непрерывных экспериментов и автоматизированного анализа.
Кроме того, биофизические методы являются комплементарными к рентгеновскому и ЯМР. Команда из Нидерландского института рака (NL) представляет рабочий процесс с использованием нанодифференциальной сканирующей калориметрии для анализа теплового сдвига для измерения изменений целевой температуры плавления при добавлениифрагментов. За предпосылками в отношении качества и концентрации белка следует аналитический протокол для планирования эксперимента, сбора и анализа данных.
На пути к клеточной структурной биологии
Криоэлектронная томография часто является методом выбора для изучения высокомолекулярных комплексов в клетках. Изображения из остеклованных образцов получают под разными углами наклона, и реконструируют 3D-томограмму, из которой извлекают подобъемы для получения более высокого разрешения путем усреднения субтомограммы. Поскольку электроны сильно взаимодействуют с веществом, для таких исследований требуются образцы толщиной менее 200 нм. Команда CEITEC (CZ) представляет протокол10 для подготовки ячеистых ламелей после погружной заморозки. Несмотря на то, что автоматизация в крио-ЭТ достигла впечатляющих успехов, требуется несколько часов сбора данных, прежде чем произойдет сбор данных с помощью серии наклона, и цели обычно по-прежнему идентифицируются с помощью визуального осмотра сетки. Компания EMBL Heidelberg (DE) подготовила протокол автоматизации для картографирования сеток и квадратов сетки, выбора целей и настройки захвата серии наклона11.
Синхротроны ALBA (ES) и Diamond совместно обсуждают подводные камни и преимущества альтернативы крио-ЭМ томографии, позволяющей исследовать интактные клетки, а именно криомягкой рентгеновской томографии (cryo-SXT)12. Адаптация методов сверхвысокого разрешения к криогенным температурам позволяет проводить корреляционную визуализацию с помощью крио-ET и cryo-SXT. Кроме того, высокопроизводительная криоструктурная световая микроскопия (cryo-SIM) удваивает разрешение обычной флуоресценции, что приводит к определенному расположению молекул или структур в толстых образцах. Это может быть соотнесено с крио-SXT для точного определения специфических особенностей в клеточном контексте.
Команда Утрехтского университета (NL) сообщает о подготовке образцов и высокочувствительных твердотельных экспериментах ЯМР, которые могут быть использованы для изучения сложных физиологических систем, включая естественные мембраныи белок-липид-гликановые системы. Кроме того, быстро развивается внутриклеточный раствор ЯМР для выяснения функциональных процессов. Команда CERM/CIRMMP (IT) описывает, как собрать и эксплуатировать биореакторы, которые позволяют пополнять запасы питательных веществ и кислорода для живых клеток внутри зонда ЯМР в ядре магнита с высоким полем15. Это позволяет проводить расширенные измерения и эксперименты с временным разрешением, например, для мониторинга внутриклеточных белок-лигандных взаимодействий.
Заключительные замечания
Этот выпуск JoVE полностью посвящен последним разработкам в области структурной биологии и ее применению в европейских исследовательских инфраструктурах. Вместе iNEXT-Discovery и Instruct-ERIC позволяют специалистам в области структурной биологии, а также неспециалистам в области биологии и другим исследователям реализовывать свои исследовательские цели, предлагая самые современные услуги.