Трансплантация индуцированной человеком плюрипотентной микроглии, полученной из стволовых клеток, в мозг иммунокомпетентных мышей неинвазивным трансназальным путем

Summary

Протокол, представленный здесь, позволяет трансплантировать индуцированную плюрипотентную микроглию человека, полученную из стволовых клеток (iPSMG), в мозг трансназальным путем у иммунокомпетентных мышей. Показан способ получения и трансназальной трансплантации клеток и введения цитокиновой смеси для поддержания иПСМГ.

Abstract

Микроглии представляют собой специализированную популяцию макрофагоподобных клеток головного мозга. Они играют важную роль как в физиологических, так и в патологических функциях мозга. Большая часть нашего нынешнего понимания микроглии основана на экспериментах, проведенных на мышах. Микроглия человека отличается от микроглии мыши, и, таким образом, реакция и характеристики микроглии мыши не всегда могут представлять собой реакцию и характеристики микроглии человека. Кроме того, из-за этических и технических трудностей исследования микроглии человека ограничиваются системой культур in vitro , которая не капитулирует in vivo характеристики микроглии. Для преодоления этих проблем разработан упрощенный метод неинвазивной трансплантации индуцированной плюрипотентной микроглии человека, полученной из стволовых клеток (iPSMG), в мозг иммунокомпетентных мышей трансназальным путем в сочетании с фармакологическим истощением эндогенной микроглии с использованием антагониста рецептора колониестимулирующего фактора 1 (CSF1R). Этот протокол обеспечивает способ неинвазивной трансплантации клеток в мозг мыши и поэтому может быть ценным для оценки роли in vivo микроглии человека в физиологических и патологических функциях мозга.

Introduction

Микроглии представляют собой специализированную популяцию макрофагоподобных клеток в центральной нервной системе (ЦНС) и играют важную роль в контроле различных функций мозга, таких как развитие нейронных цепей, модуляция нейротрансмиссии и поддержание гомеостаза мозга ^1,2,3. Хотя мышиные микроглии имеют много общих функций с функциями человека, они показывают видоспецифичные различия. Таким образом, реакция мышиной микроглии на различные раздражители не всегда может представлять собой реакцию микроглии человека ^4,5,6. Хотя во многих исследованиях анализировалась микроглия человека, эти эксперименты ограничены исследованиями in vitro. Культивируемые in vitro микроглии человека проявляют морфологические особенности и экспрессию генов, которые сильно отличаются от таковых in vivo. Таким образом, эксперименты in vitro не всегда могут капитулировать над характеристиками микроглии человека in vivo. Поэтому необходима экспериментальная система для изучения микроглии человека in vivo.

Недавно, для изучения характеристик микроглии человека in vivo, генерируемые in vitro индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) - или эмбриональные стволовые клетки, полученные из человеческих микроглий, хирургически пересаживаются в мозг мышей 7,8,9,10,11,12,13,14. С помощью этого подхода были охарактеризованы различные особенности микроглии человека in vivo. Однако широкое использование этого метода ограничено по двум причинам. Во-первых, это потребность иммунодефицитных мышей. Таким образом, для изучения роли микроглии человека в различных нейродегенеративных заболеваниях мышей, несущих мутации заболевания, приходится скрещивать с иммунодефицитными мышами, что требует значительного времени и усилий. Кроме того, при различных неврологических расстройствах периферические иммунные клетки, такие как Т-клетки, могут модулировать функции микроглии 15,16,17. Поэтому эксперименты, проведенные на мышах с иммунодефицитом, могут не представлять добросовестных характеристик микроглии человека in vivo. Во-вторых, инвазивные операции по пересадке микроглии требуют дополнительного оборудования и обучения. Кроме того, черепно-мозговая травма во время инвазивной трансплантации может изменить фенотипы микроглии.

В этом протоколе описана неинвазивная трансназальная трансплантация (Tsn) iPSMG иммунокомпетентным мышам дикого типа¹⁸. Комбинируя фармакологическое включение / выключение антагониста CSF1R PLX5622, который истощает эндогенную микроглию мыши¹⁹ и Tsn, iPSMG может быть неинвазивно пересажен в мозг мыши. Кроме того, при применении экзогенного человеческого цитокина трансплантированный iPSMG остается жизнеспособным в течение 60 дней специфическим для региона способом без каких-либо иммунодепрессантов.

Protocol

Все животные, использованные в этом исследовании, были получены, размещены, ухожены и использованы в соответствии с «Руководящими принципами ухода и использования животных в области физиологических наук», опубликованными Физиологическим обществом Японии²⁰, и с предыдущего одобрения Комитета по уходу за животными Университета Яманаси (Yamanashi, Япония).

1. Приготовление клеточной среды, трансплантационной среды и анестезиологической смеси

1. Подготовьте клеточную среду, добавив 10% фетальной бычьей сыворотки и 0,1% пенициллина/стрептомицина в DMEM.
2. Подготовьте трансплантационную среду, добавив в клеточную среду hCSF1 (250 нг/мл) и hTGF-β1 (100 нг/мл).
3. Готовят анестезиологическую смесь для внутрибрюшинной инъекции, смешивая 0,45 мл медетомидина гидрохлорида, 1,2 мл мидазолама и 1,5 мл тартрата буторфанола в 11,8 мл обычного физиологического раствора.

2. Подготовка iPSMG

ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженный iPSMG (Таблица материалов) выдерживали при -80 °C до использования.

1. Быстро разморозьте замороженные клетки на водяной бане с температурой 37 °C. Вращайте образцы до тех пор, пока весь видимый лед не растает.
2. Добавьте размороженный iPSMG в культуральную среду, нагретую до 37 °C. Добавьте 1 мл размороженных клеток, содержащих среду (1 × 10⁶ клеток) к 10 мл культуральной среды.
3. Центрифугируют ячейки при 300 х г в течение 5 мин для получения ячейки гранулы.
4. После центрифугирования удалите все супернатанты, не нарушая гранулу клетки. Полное удаление надосадочного вещества желательно для уменьшения разбавления концентрации цитокинов в трансплантационной среде.
5. Добавьте трансплантационную среду для получения клеточной концентрации 1 х 10⁵ клеток/мкл.
6. Поместите iPSMG на лед и сразу приступайте к пересадке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка iPSMG к трансплантации проводится на чистом стенде во избежание загрязнения.

3. Подготовка мыши к трансназальной трансплантации (Tsn)

1. Кормите самцов мышей дикого типа (C57BL/6J, 8 недель) plX5622, содержащим рацион в течение 7 дней.
2. В конце^7-го дня прекратите диету PLX и кормите мышей нормальным рационом до конца исследования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PLX5622, содержащий диету, готовят путем добавления 1,2 г PLX5622 в 1 кг AIN-93G (Таблица материалов).

4. Трансназальная трансплантация клеток

1. Через 24 ч после прекращения кормления PLX взвешивают мышей и обезболивают их с помощью внутрибрюшинной инъекции анестезиологической смеси (0,2 мл/20 г).
2. После того, как мыши полностью обезболены, как оценивается по невосприимчивости к рефлексу снятия педали (твердое защемление пальца ноги), вводят 2,5 мкл гиалуронидазы в PBS (100 ЕД / мл) за 1 ч до Tsn iPSMG в каждую ноздрю дважды, используя кончик пипетки 10 мкл для увеличения проницаемости слизистой оболочки носа.
3. После применения гиалуронидазы поместите мышей в положение лежа на спине.
4. Повторите шаг за 4,2 10 мин до трансназальной трансплантации иПСМГ.
5. Нанесите 2,5 мкл клеточной суспензии в одну ноздрю мыши с помощью кончика пипетки объемом 10 мкл.
6. Поместите мышь в положение лежа на спине на 5 мин перед введением клеточной суспензии в другую ноздрю.
7. Повторите шаги 4,5 и 4,6 четыре раза, применяя общий объем 20 мкл на животное.
8. Поместите мышь в положение лежа на спине на грелке с температурой 37 °C до восстановления после анестезии.
9. Через 48 ч после прекращения кормления PLX повторите шаги 4,1-4,7 на тех же мышах еще раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что iPSMG помещаются на лед во время трансплантации.

5. Применение цитокинов

1. Обезболивают мышей внутрибрюшинной инъекцией анестезиологической смеси (0,2 мл/20 г).
2. Нанесите 2,5 мкл трансплантационной среды в одну ноздрю мыши с помощью кончика пипетки объемом 10 мкл.
3. Поместите мышь в положение лежа на спине на 5 мин перед введением трансплантационной среды в другую ноздрю.
4. Повторите шаги 5,2 и 5,3 четыре раза, применяя общий объем 20 мкл на животное.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что трансназальное введение трансплантатационной среды (цитокинов человека) требуется каждые 12 ч для жизнеспособности трансплантированного иПСМГ до конца исследования.

Results

Этот метод позволяет исследователю неинвазивно трансплантировать iPSMG в гиппокамп и мозжечок, но не в кору головного мозга мыши. После завершения исследования обезболенных мышей подвергали транскардиальной перфузии ледяного PBS(−), за которой следовал ледяной 4% (мас./об.) параформальдегид в PBS. Мозги были изолированы, постфиксированы на ночь в 4% (мас./об.) параформальдегида и криопротектированы в PBS, содержащем 30% (мас./v) сахарозы. Кроме того, мозг был заморожен во встраивающем соединении и разделен (корональные сечения толщиной 20 мкм) на криостате. Срезы трижды промывали в PBS(−) (по 10 мин) и пермеабилизировали и блокировали 0,5% (v/v) Triton X-100 в 10% нормальной козьей сыворотке в течение 1 ч. Затем секции инкубировали с античеловеческим маркером цитоплазмы STEM121 (1:100) и анти-Iba1 (1:1000) в течение 5 дней. Далее секции промывали три раза PBS(−) по 10 мин каждая и инкубировали со вторичными антителами: Alexa Fluor 488-, или 546-конъюгированной мышью, или кроликом IgGs (1:1000) в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки PBS(-) три раза секции монтировались на слайдах с использованием антизатухнего монтажного носителя. Для получения флуоресцентных изображений использовался конфокальный микроскоп, оснащенный объективом 40x. Жизнеспособность iPSMG через 2 месяца после трансплантации в гиппокампе и коре головного мозга показана на рисунке 1. Количество трансплантированных клеток может быть определено путем подсчета клеток, которые являются положительными как для специфических для человека антител, так и для маркеров пан-микроглии / моноцитов, тогда как эндогенные мышиные микроглии положительны для пан-микроглиального / моноцитарного маркера только как описано ранее¹⁸. Трансплантированные iPSMG заменяют микроглию мыши, показывают разветвленную морфологию в гиппокампе и не обнаруживаются в коре¹⁸.

Рисунок 1: Жизнеспособность iPSMG в коре головного мозга и гиппокампе через 2 месяца после Tsn. На левой панели показано иммуноокрашивание панмикроглиальным/моноцитарным маркером Iba1 (зеленый). На средней панели показано иммуноокрашивание специфическим для человека маркером цитоплазмы STEM121 (красный). На правой панели показано объединенное изображение иммуноокрашивания Iba1 и STEM121. (A) У контрольных мышей была обнаружена только мышиная микроглия (Iba1+/STEM121-) как в коре, так и в гиппокампе. (B) У мышей, пересаженных iPSMG, в коре головного мозга была обнаружена только микроглия мыши (Iba1 ⁺/STEM121^-), тогда как в гиппокампе iPSMG (Iba1⁺/STEM121⁺). Стрелки на изображении показывают микроглию мыши, в то время как стрелки показывают iPSMG. Конфокальный микроскоп, оснащенный объективом 40x, использовался для получения флуоресцентного изображения. Максимальный размер изображения: 1024 x 1024 пикселей. Коэффициент масштабирования: 2. Шкала = 50 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Протокол здесь описывает неинвазивную трансплантацию iPSMG в мозг мыши. Уникальность текущего протокола заключается в том, что, сочетая фармакологические методы PLX ON/OFF и интраназальную трансплантацию, iPSMG может быть неинвазивно пересажен в иммунокомпетентный мозг мыши. Трансплантированный iPSMG сформировал большую часть микроглии в гиппокампе и мозжечке, занимая свободную нишу на срок до 60 дней, но не в коре.

Критическими точками для эффективного Tsn iPSMG являются (i) эффективность истощения эндогенной микроглии мыши,(ii) введение цитокинов человека каждые 12 ч. Микроглии поддерживают собственную территорию в головном мозге. Эффективное истощение микроглии мыши требуется, чтобы обеспечить нишу для приживления трансплантированного iPSMG. Когда истощение эндогенной микроглии мыши недостаточно, колонизации гиппокампа и мозжечка iPSMG не наблюдается. Жизнеспособность микроглии зависит от CSF1R и TGFBR сигнализации 19,21,22. Сообщается, что hCSF1 избирательно повышает жизнеспособность микроглии человека, а hTGF-β1 необходим для жизнеспособности микроглии, а также гасит воспаление при введении каждые 12 ч 21,23,24. При отсутствии экзогенных цитокинов человека iPSMG не наблюдаются в мозге мыши. Кроме того, необходимо соблюдать осторожность, чтобы механически не активировать iPSMG путем чрезмерного пипетирования или любыми другими способами до Tsn, поскольку это необратимо изменяет характеристики iPSMG, а также эффективность трансплантации. Если удовлетворительный Tsn iPSMG не виден, необходимо определить жизнеспособность iPSMG перед трансплантацией, а также истощение эндогенной микроглии. Если истощение эндогенной микроглии мыши составляет не более 90%, время кормления PLX5622 может быть модифицировано для увеличения истощения.

По сравнению с обычным хирургическим методом трансплантации, который является инвазивным и требует дополнительного оборудования и обучения, Tsn позволяет проводить трансплантацию неинвазивным, простым, стабильным и легким способом. Кроме того, этот метод позволяет трансплантировать iPSMG в мозг иммунокомпетентных мышей; таким образом, модели иммунокомпетентного заболевания мышей могут быть использованы для изучения ответа iPSMG.

Наибольшим недостатком современного метода является региональная неоднородность в приживлении iPSMG. Если требуется трансплантация iPSMG, специфичная для области мозга, текущий протокол не подходит, так как трансплантированный iPSMG остается приживленным в течение 60 дней только в гиппокампе и мозжечке, но не в коре. Кроме того, необходимость введения экзогенных цитокинов человека интраназально каждые 12 ч также является ограничением текущего протокола, поскольку он требует обширной рабочей силы и является дорогостоящим.

В заключение приведен подробный протокол для Tsn iPSMG в мозг иммунокомпетентных мышей. В сочетании с фармакологическим включением/ выключением микроглии мыши PLX5622 этот протокол позволяет успешно приживить iPSMG. Поскольку трансплантированные клетки могут наблюдаться в гиппокампе и мозжечке в течение длительного периода времени, когда применяются экзогенные цитокины, современный метод может быть полезен для оценки роли микроглии человека как в физиологических, так и в патологических состояниях в этих областях.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	10566
AIN 93G	Антитела к восточным дрожжам Co
Anti-Iba1	FUJIFILM	019– 19741
Антитело против STEM121	Takara Bioscience	Y40410
Буторфанола тартрат	Kyoritsu Seiyaku	8019
Конфокальный микроскоп	Olympus	FV1200
Фетальная бычья сыворотка	GE Healthcare Life Sciences	SH30070.03
Замороженный iPSMG	Shionogi & Co., Ltd		Лаборатория для Разработка лекарств и исследования болезней
Колониестимулирующий фактор человека 1 (hCSF1)	PeproTech	300-25
Гиалуронидаза	Sigma-Aldrich	H-3506
Медетомидина гидрохлорид	Meiji Seika	VETLI5
Мидазолам	Астеллас	18005A2
Параформальдегид	Wako Pure Chemical Industries	162-16065
Пенициллин/стрептомицин	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Пипетка	Eppendorf	3120000011
Наконечник для пипетки	Eppendorf	30076028
PLX5622	Amadis Chemical	A930097
Transforming growth factor-β 1 (Tgf-b1)	PeproTech	100-21
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
VECTA SHIELD жесткий монтаж Medium	Vector Laboratories	H-1400-10	Защитный материал