Извлечение модифицированных микротрубочек из клеток млекопитающих для изучения микротрубочек-белковых комплексов методом криоэлектронной микроскопии

Микротрубочки являются важной частью цитоскелета; Они участвуют в различных функциях, таких как миграция и деление клеток, но также вносят свой вклад во внутриклеточную организацию. Чтобы адаптироваться к различным функциональным судьбам, микротрубочки взаимодействуют с различными белками, связанными с микротрубочками (MAP), ферментами и другими белками, которые мы будем в совокупности называть «белками, взаимодействующими с микротрубочками». Связывание этих белков с микротрубочками может определяться различными модификациями тубулина, обычно называемыми «тубулиновым кодом»¹. Примерами такого предпочтения являются митотический центромер-ассоциированный кинезин (MCAK)2 и динеин-динактиновый домен CAP-Gly p150³, которые предпочтительно связываются с тирозинированным тубулином, в то время как кинезиновые моторы центромер-ассоциированного белка E (CENP-E)⁴ и кинезина-2⁵ предпочитают тубулин, в котором отсутствует С-концевой тирозин.

В то время как для изучения взаимодействий микротрубочек и белков можно использовать различные методы, криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) часто используется для изучения этих взаимодействий с околоатомным разрешением ^6,7. В последние годы крио-ЭМ-структуры показали, как крупные моторные белки, такие как динеин 8,9,10 и кинезин¹¹, белки +TIP, такие как EB3^12,13 и MCAK 14, другие белки, такие как Tau^15,16, и даже небольшие молекулы, такие как паклитаксел^, пелорусид и зампанолид ¹⁷ взаимодействуют с микротрубочками. Для изучения взаимодействия микротрубочек с белками микротрубочки обычно извлекают из мозга свиньи¹⁸. После этого большинство исследований in vitro, включая структуры микротрубочек крио-ЭМ, проводятся с использованием тубулина головного мозга свиньи. Таким образом, результаты этих исследований скрывают важность гетерогенной природы модификаций тубулина¹⁹ между тканями и типами клеток. Это создает особую проблему при исследовании белка, который требует или предпочитает специфическую модификацию для связывания с микротрубочками. Это может быть проиллюстрировано тирозинированным тубулином, субстратом для детирозиназы микротрубочек MATCAP.

Детирозинирование представляет собой модификацию тубулина, при которой отсутствует С-концевая аминокислота тирозин α-тубулина, что связано с митотической, сердечной и нейрональной функцией²⁰. В то время как полностью тирозинированные микротрубочки являются идеальным субстратом для MATCAP, он в значительной степени отсутствует в коммерчески доступных микротрубочках из мозга свиньи из-за функции вазохибинов 21,22 и MATCAP 23-детирозиназ в этой ткани 22,23,24,25,26. Хотя коммерчески доступный тубулин HeLa в основном содержит тирозинированные микротрубочки, может произойти детирозирование, и поэтому этот источник тубулина менее подходит для создания однородного образца для крио-ЭМ-анализа.

Чтобы стимулировать связывание MATCAP с микротрубочками и создать однородный образец для структурного анализа, мы искали источник микротрубочек, который полностью тирозинирован. С этой целью была создана клеточная линия с дефицитом MATCAP и вазохибина, которая использовалась для извлечения полностью тирозинированных микротрубочек. Процедура экстракции была основана на хорошо зарекомендовавших себя протоколах, которые используют повторяющиеся циклы полимеризации и деполимеризации микротрубочек для извлечения тубулина из ткани мозга или клеток 18,27,28,29,30^, только с одной стадией полимеризации и центрифугированием над глицериновой подушкой. Используя MATCAP в качестве примера, мы затем продемонстрируем, как эти микротрубочки могут быть использованы для крио-ЭМ-исследований. Для приготовления крио-ЭМ сеток описан двухэтапный протокол применения при низкой концентрации соли. Методы, описанные в этой статье, описывают экстракцию настраиваемых микротрубочек в достаточных количествах и чистоте для выполнения крио-ЭМ-анализа и предоставляют подробный протокол о том, как использовать эти микротрубочки для создания комплексов белок-микротрубочки на крио-ЭМ-сетках.

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах и оборудовании, используемых в этом протоколе.

1. Клеточная культура

ПРИМЕЧАНИЕ: Все клеточные культуры следует проводить в стерильном ламинарном колпаке.

1. Чтобы следовать этому протоколу, сначала разморозьте флакон с замороженными клетками на водяной бане с температурой 37 °C. Здесь мы используем генетически модифицированную клеточную линию HCT116, в которой отсутствуют три известных детирозинирующих фермента, VASH1, VASH2 и MATCAP, для создания тирозинированного тубулина.
2. Подготовьте пластину Ø 10 см, содержащую 10 мл соответствующей среды для культивирования клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе для генетически модифицированной клеточной линии HCT116 использовали DMEM (модифицированная среда Eagle Dulbecco) с добавлением 10% v/v FCS (эмбриональная сыворотка теленка) и антибиотик пенициллин/стрептомицин (питательная среда).
3. Подсчитайте ячейки и посейте ~2,5 × 10⁶ жизнеспособных клеток (~20% слияния) в подготовленную 10-сантиметровую тарелку. Аккуратно встряхните пластину, чтобы равномерно распределить ячейки. Инкубируйте чашку в инкубаторе клеточных культур с температурой 37 °C, отравленном газом 5% (об./об.) CO₂ до тех пор, пока клетки не достигнут слияния 80-90%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно это занимает 3 дня для клеток HCT116, но время может зависеть от конкретной плотности посева и используемой клеточной линии.
4. Выбросьте питательную среду для клеток с помощью пипетки или вакуум-аспиратора и вымойте посуду 2 x 5 мл PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не слишком сильно наносить PBS на монослой ячейки, так как это может отсоединить ячейки от пластины.
5. Добавьте 1-2 мл трипсина и инкубируйте клетки в инкубаторе в течение 2-5 минут, чтобы отделить клетки.
6. Добавьте 2 мл питательной среды в пластину для гашения трипсина.
7. Разделите клеточную суспензию на три-пять равных частей и пересейте их для расширения клеток в питательной среде до получения 6-12 сливающихся 15-сантиметровых пластин.

2. Сбор урожая

1. Аккуратно промойте клетки 10 мл PBS (1x), чтобы удалить любую среду для культивирования клеток.
2. Отделите клетки от планшетов, инкубируя клетки в течение 5 минут при комнатной температуре с 3 мл ледяного PBS с добавлением 5 мМ ЭДТА (стерильный/отфильтрованный) и, следовательно, с помощью клеточного скребка.
3. Соберите клетки в пробирку объемом 50 мл на льду и открутите вниз (10 мин, 250 × г).
   1. Обратите внимание на объем собранных клеток с помощью объемной шкалы на пробирке 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый объем может составлять от ~ 0,5 мл до 4 мл. ШАГ ПАУЗЫ: Заморозьте гранулы ячейки в LN2 и храните при температуре -20 °C до использования. Обратите внимание, что клеточный пеллет можно хранить только в течение нескольких недель или месяцев. Если гранулы хранятся дольше, это может привести к снижению выхода или отсутствию микротрубочек вообще.

3. Экстракция микротрубочек

ПРИМЕЧАНИЕ: Держите все для шагов 3.1-3.5 на льду; все, начиная с шага 3.6, должно храниться в тепле (30-37 ° C).

1. Приготовьте 10 мл ледяного буфера для лизиса, содержащего 100 мМ труб / КОН (pH 6,9), 2 мМ EGTA / KOH, 1 мМ MgCl₂, 1 мМ PMSF и одну таблетку ингибитора протеазы (мини).
2. Ресуспендируйте собранную клеточную гранулу в буфере лизиса 1:1 v/v (если вы сомневаетесь в точном объеме, возьмите меньше буфера лизиса, а не больше).
3. Лизируйте клетки ультразвуком: 15 с вкл., 45 с выкл., amp 30, четыре цикла (определите условия экспериментально и измените в соответствии с ультразвуковым аппаратом).
   1. После обработки ультразвуком соберите образец для анализа SDS-PAGE: 2 мкл лизата + 18 мкл воды + 5 мкл 5x буфера образца SDS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте под стандартным световым микроскопом, действительно ли клетки полностью лизировались.
4. Поместите лизированные клетки пипеткой в центробежную пробирку. Отжим в течение 1 ч при 100 000 × г при 4 °C в роторе ультрацентрифуги для очистки лизата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все карманы в роторе сухие и чистые, чтобы обеспечить правильную балансировку центрифуги.
5. Используйте шприц, чтобы извлечь очищенный лизат. Следите за тем, чтобы не нарушить гранулы, а также плавающий слой сверху.
   1. Соберите образец очищенного лизата: 2 мкл лизата + 18 мкл воды + 5 мкл буфера для образца 5x SDS.
   2. Тщательно промойте гранулы и зачерпните немного гранул, проведя наконечником пипетки P10 через гранулу; добавьте 200 мкл воды и 50 мкл буфера SDS.
6. Дополните надосадочную жидкость из предыдущего этапа 1 мМ ГТФ и 20 мкМ паклитаксела для полимеризации микротрубочек; для объема 1 мл добавьте 10 мкл 2 мМ паклитаксела и 10 мкл 100 мМ ГТФ.
   ВНИМАНИЕ: Паклитаксел может вызвать раздражение кожи, серьезное повреждение глаз, раздражение дыхательных путей, генетические дефекты, повреждение нерожденного ребенка и повреждение органов. Длительное или многократное воздействие вызывает повреждение органов. Ни в коем случае не вдыхайте, не распыляйте и не вытирайте пыль с вещества. Надевайте резиновые нитриловые перчатки, чтобы предотвратить контакт с кожей.
7. Инкубируйте надосадочную жидкость с добавлением ГТФ/паклитаксела в течение 30 мин при 37 ° C, чтобы микротрубочки могли собраться.
8. На этом этапе инкубации дайте ротору и ультрацентрифуге нагреться до 30 °C.
9. Подготовьте буфер-подушку: добавьте 0,6 мл глицерина к 0,4 мл буфера для лизиса и дополните смесь 20 мкМ паклитакселом. Разогрейте буферную подушку до 37 °C.
10. Добавьте 800 мкл буфера-подушки в ультрацентрифужную пробирку. Осторожно нанесите пипеткой лизат с добавлением ГТФ/паклитаксела поверх буфера-подушки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предотвратите смешивание буфера-подушки и лизата путем очень осторожного пипетирования.
11. Отжим в течение 30 мин при 100 000 × g при 30 °C в роторе ультрацентрифуги. Отметьте направленный наружу край центрифугирования, чтобы легко распознать, где должна образоваться гранула микротрубочки.
12. Осторожно извлеките буфер-подушку с помощью пипетки, стараясь не повредить гранулы микротрубочек.
    1. Соберите образец буфера-подушки: 2 мкл + 18 мкл воды + 5 мкл 5-кратного буфера для образцов SDS.
13. Тщательно промойте гранулы 3 раза теплым буфером для лизиса, чтобы удалить глицерин. Аккуратно распределите теплый буфер рядом с гранулой (не смывая жидкость непосредственно над гранулой), поверните трубку несколько раз, чтобы удалить как можно больше глицерина из гранулы и стенок пробирки, а затем аспирируйте и повторите.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если глицерин не смывается должным образом, сетка очень быстро расплавится под электронным освещением. Об этом может свидетельствовать высокое движение частиц, создающее размытые изображения.
14. Приготовьте буфер для ресуспендирования со следующими ингредиентами: 100 мМ труб / КОН (pH 6,9), 2 мМ EGTA/KOH и 1 мМ MgCl₂, и нагрейте буфер до 37 ° C.
15. Осторожно ресуспендируйте промытые гранулы с отрезанным наконечником в ~ 50 мкл предварительно разогретого буфера ресуспендирования и держите пробирку при 37 °C.
    1. Соберите пробу ресуспендированной фракции гранул: 2 мкл + 18 мкл воды + 5 мкл 5-кратного буфера для образцов SDS.
       СОВЕТ: Разрезанный наконечник предотвращает разрушение микротрубочек. Подготовьте металлический нагревательный блок до 37 °C и храните его в коробке из полистирола, чтобы пробирки с образцами можно было легко транспортировать, не охлаждая их до комнатной температуры.

4. Подготовка крио-ЭМ решетки

1. Подготовьте устройство погружной морозильной камеры, установив промокательную бумагу. Нагрейте морозильную камеру до 30 °C и установите увлажнение на 100%. Подождите ~ 30 минут, чтобы сбалансировать температуру и влажность.
2. Подготовьте настройки погружной морозильной камеры для двух приложений и один раз запустите всю программу, чтобы убедиться, что настройки установлены правильно. Убедитесь, что первое приложение имеет силу 10, 2 с времени промокания и 0 с времени ожидания, а второе приложение имеет время промокания 10, 6,5 с и время ожидания 10 с.
3. Тлеющий разряд крио-ЭМ решеток при 30 мА в течение 60 с.
4. Охладите сборку контейнера из полистирола с помощью LN2 и приготовьте жидкий этан в металлической чашке, конденсируя газообразный этан в холодную металлическую чашку.
5. Приготовьте буфер для разбавления со следующими компонентами: 100 мМ ТРУБ/КОН (pH 6,9), 2 мМ EGTA/KOH и 1 мМ MgCl₂, и нагрейте его до 37 °C.
6. Разбавьте белок, взаимодействующий с микротрубочками, 1:1 об. / об., буфером для разбавления непосредственно перед нанесением его на решетки, чтобы обеспечить снижение концентрации соли (мы использовали конечную концентрацию соли 50 мМ NaCl). Хранить смесь при температуре 37 °C.
7. Возьмите светящуюся разряженную решетку пинцетом и вставьте их в морозильную камеру.
8. Поместите контейнер из полистирола с жидким этаном в погружную морозильную камеру и выполните подготовленную программу: сначала нанесите 3,5 мкл раствора микротрубочек на решетку, дайте погружной морозильной камере промокнуть решетку, затем сразу же нанесите 3,5 мкл свежеразбавленного белка и, наконец, дайте поршню промокнуть и заморозить решетку в жидком этане.
9. Перенесите сетки в ящик для хранения сетки и храните их в дьюаре LN2 до получения изображения.

Мы исследовали тубулиндетирозиназу MATCAP, связанную с тирозинированными микротрубочками с помощью крио-ЭМ. Для этого мы извлекли полностью тирозированные микротрубочки из генетически модифицированной клеточной линии HCT116, в которой отсутствуют все три известных детирозинирующих фермента, VASH1/2 и MATCAP. Мы использовали 6-12 сливающихся 15-сантиметровых чашек для извлечения микротрубочек примерно из 0,5-4 мл клеточной гранулы (рис. 1). После второй стадии центрифугирования (этап 3.11) получается видимая, но маленькая и прозрачная гранула (рис. 1I). Выход микротрубочек обычно составляет ~ 75 мкг. Если гранула не видна, это может указывать на проблему на одном из предыдущих этапов, такую как неправильная температура полимеризации микротрубочек, проблемы с качеством используемого ГТФ или паклитаксела или добавление слишком большого буфера лизиса, что приводит к концентрации тубулина, которая слишком мала для полимеризации. Чтобы оценить качество и концентрацию экстрагированных микротрубочек, мы проанализировали образцы на окрашенном Кумасси геле SDS (рис. 2А). Эти анализы показали, что извлеченные микротрубочки были относительно чистыми. Интерполированная концентрация микротрубочек, полученная в результате количественного определения BSA, составила ~ 1,4 мг / мл. Это хорошо согласуется с числом, измеренным спектрофотометром (рис. 2B, C).

Свежеизвлеченные микротрубочки могут быть непосредственно использованы для изготовления образцов для крио-ЭМ. Микротрубочки должны выглядеть неповрежденными и обильными на микрофотографиях. Для дальнейшего крио-ЭМ-анализа важно иметь низкую плотность микротрубочек на микрофотографию, чтобы избежать пересечения микротрубочек друг с другом (рис. 3A). Сломанные микротрубочки или те, которые не видны, могут указывать на то, что микротрубочки деполимеризовались (например, из-за низкой температуры или гидролиза ГТФ) или что параметры блоттинга и замораживания погружением были установлены неправильно. Фон вокруг микротрубочек плотный, предположительно с неполимеризованным тубулином.

Молекулярная масса MATCAP составляет 53 кДа, и он имеет глобулярный каталитический домен чуть ниже размера мономера тубулина. Таким образом, украшение MATCAP на микротрубочках может быть обнаружено визуально. Микротрубочки, которые не связывали MATCAP, имели «гладкие» края, тогда как микротрубочки, которые связывали MATCAP, имели «шероховатые» края, характеризующиеся электронно-плотными точками на поверхности микротрубочек (рис. 3B). Микротрубочки, связанные с MATCAP, и микротрубочки, не связанные с MATCAP, также могут быть выделены в рассчитанных 2D-классах, хотя из-за формы и размера это может отличаться для других белков, взаимодействующих с микротрубочками (рис. 3C). Чтобы подтвердить, что плотность действительно принадлежит интересующему белку, можно воспользоваться экспериментально определенными или предсказанными структурами. Мы также предлагаем сделать контрольную сетку, содержащую микротрубочки только для сравнения. Это указывает на то, были ли микротрубочки полимеризованы и экстрагированы неповрежденными в достаточно высокой концентрации и что процесс погружения был выполнен правильно. Мы заметили, что обилие микротрубочек уменьшилось в сетках при повторном применении MATCAP.

Рисунок 1: Визуальное руководство экспериментальными шагами. (A) Клеточный гранул перед лизисом; (B) обработанные ультразвуком клетки в ультрацентрифужной трубке перед центрифугированием; (C) обработанные ультразвуком клетки в ультрацентрифужной пробирке после центрифугирования; (D) шприц с очищенной надосадочной жидкостью; Е) остаточные гранулы после удаления надосадочной жидкости, включая "белый плавающий слой"; f) наконечник P10 с гранулами клеточного мусора для геля SDS Coomaxie; (G) супернатант с добавлением ГТФ/паклитаксела перед инкубацией; h) супернатант, инкубированный ГТФ/паклитакселом, поверх глицериновой подушки в ультрацентрифужной пробирке; (I) очистить гранулы микротрубочек после второй стадии центрифугирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Определение чистоты и концентрации микротрубочек . (A) Окрашенный в Кумасси страничный гель SDS, показывающий образцы, взятые во время протокола экстракции, и сравнение концентраций BSA. S1 и P1 соответствуют надосадочной жидкости и грануле после первой стадии центрифугирования соответственно. S2 и P2 аналогично соответствуют второй стадии центрифугирования. (B) Линия нелинейной регрессии относительных величин BSA, полученных из A. Интерполяция полосы микротрубочек около 50 кДа в полосе P2 (микротрубочки) указывает на конечную концентрацию 1,42 мг/мл. (C) Спектрофотометрический анализ ресуспендированных микротрубочек (P2), измеренный двумя людьми и скорректированный на комбинированный коэффициент экстинкции TUBA1A и TUBB3 (0,971), указывает на среднюю и стандартную концентрацию отклонения 1,46 мг/мл ± 0,14 мг/мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Пример микрофотографий. (A) Пример микрофотографий, демонстрирующих микротрубочки, связанные с MATCAP. Микротрубочки, обозначенные зеленым прямоугольником, не повреждены, украшены и могут быть использованы для крио-ЭМ-анализа. Микротрубочка, обозначенная оранжевой рамкой, представляет собой неповрежденную и украшенную микротрубочку, но расположена близко к микротрубочкам слева от нее; поэтому его менее подходит для включения в крио-ЭМ-анализ. Микротрубочки в красной коробке пересекаются и ломаются. Они должны быть исключены из крио-ЭМ-анализа. (B) Увеличенный вид микротрубочки левой панели, окруженной зеленым цветом. Красные наконечники стрелок указывают на черные точки, которые появились только на микротрубочках на микрофотографиях, на которых был применен MATCAP, и, таким образом, вероятно, соответствуют MATCAP, связанному с микротрубочками. (C) Пример 2D-классов частиц микротрубочек, выбранных из A, которые показали высокое и низкое украшение, и 2D-класс из другого набора данных, для которого мы не наблюдали украшения с помощью MATCAP (крайняя правая панель). Масштабные линейки = (A) 50 нм, (B) 25 нм, (C) 10 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Иммуноблоттинг-анализ микротрубочек, полученных из клеток HCT116 с дефицитом MATCAP и VASH1/2 с тройным нокаутом (TKO), коммерческого мозга свиньи и тубулина HeLa. Сокращения: TKO = тройной нокаут; mAb = моноклональное антитело; pAb = поликлональное антитело. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.