Мы представляем шаг за шагом инструкции для поколения новорожденных химерами, а также вскрытие и подготовка тимуса для бывших естественных изображений на 2-Фотон микроскопии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Натурные съемки Мышь Thymus Использование 2-Фотон микроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Двухфотонное микроскопия (TPM) позволяет нам образ глубоко в вилочковой железе и документировать события, которые имеют важное значение для развития тимоцитов. Для выполнения миграции физических лиц в толпе тимоцитов, мы генерируем новорожденных химерами, где менее чем один процент тимоцитов являются производными от донора, для трансгенных повсеместно выражают флуоресцентного белка. Для создания этих частичных кроветворения химеры, неонатальной получателей вводят костного мозга от 3-7 дней от роду. После 4-6 недель, мыши приносится в жертву и тимуса тщательно расчленены и bissected сохраняя архитектуру ткани, которая будет в образ. Тимус наклеиваются на покровное в рамках подготовки к бывшим естественных изображений по TPM. Во время визуализации тимус хранится в DMEM без фенола красного, который перфузии с 95% кислорода и 5% углекислого газа и нагревают до 37 ° C. Используя этот подход, мы можем изучать события, необходимые для генерации разнообразный репертуар Т-клеток.
Протокол
Приемные Трансфер
Inject новорожденных с 50-100 мкл костного мозга использованием инсулиновый шприц 2-4 раза в течение первых 3-7 дней жизни, с окончательным донор-хост соотношении 1:1. Стремитесь к инъекции ниже грудины и грудной клетки, но, прежде кишки и желудка. Вставьте иглу достаточно далеко, чтобы проникнуть в брюшину, осторожны, чтобы не проколоть мембрану. Она не является редкостью для некоторых из костного мозга, будут потеряны во время инъекции. Вы можете уменьшить потери, ослабив контроль над вашим щенком, как Вы вводите таким образом, чтобы дать коже расширяются и, затем, медленно удаления иглы.
Препарирование Thymus
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Двухфотонное изображений в тимуса позволяет рассматривать в живых, неповрежденных органов взаимодействия и миграции, которые лежат в основе выбора события в тимусе.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конфликта интересов, требующего раскрытия.
Благодарности
Мы благодарим Мэтта Павел и Джимми Ву для оказания технической помощи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Ссылки
- Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
