Методическая статья

Получение встроенной в агаровую бусину Mycobacterium abscessus для инокуляции иммунокомпетентных мышей внутритрахеально

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67602

⸱

25 апреля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health, 2Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, 3Department of Biological Sciences, College of Science, University of Tabuk, 4Emerging Bacterial Pathogens Unit, Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 5Department of Medical Sciences, Hackensack Meridian School of Medicine, 6Department of Microbiology and Immunology, Georgetown University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мыши, как правило, устойчивы к инфекциям, вызываемым Mycobacterium abscessus, что усложняет открытие и разработку столь необходимых антибиотиков против легочных инфекций. Здесь мы описываем метод приготовления посевного материала и внутритрахеальной инфекции, который, как было показано, обеспечивает устойчивую инфекцию у иммунокомпетентных мышей.

Аннотация

Крайне необходимы надежные мышиные модели хронической инфекции Mycobacterium abscessus, патогеном из окружающей среды, который преимущественно инфицирует легкие. Многокомпонентная терапия в течение всего года обеспечивает неприемлемо низкие показатели излечения у пациентов, около 50%, что обуславливает потребность в прогностических доклинических инструментах для разработки более эффективных антибиотиков. Тем не менее, иммунокомпетентные мыши, как правило, устойчивы к легочной инфекции, вызванной M. abscessus. В литературе сообщалось о многочисленных попытках установления устойчивой инфекции M. abscessus у иммунокомпетентных мышей. Среди них наиболее перспективными оказались методы, основанные на бактериях, встроенных в шарики агара, инокулированные мышам C57BL/6 внутритрахеальным путем. Основным ограничением этого подхода является техническая проблема, связанная с получением агаровых шариков воспроизводимого размера и количества бактерий с последующим внутритрахеальным посевом. В этой статье мы сначала подробно опишем оптимизированный протокол, который доставляет нагруженные M. абсцессом шарики агара оптимального диаметра и воспроизводимой бактериальной нагрузки. Далее мы предоставляем подробный протокол внутритрахеального посева, оптимизированный для предотвращения потерь гранул и бактерий из-за прилипания к поверхностям инокуляционных устройств и для достижения воспроизводимого легочного отложения M. abscessus, встроенного в агар. Цель состоит в том, чтобы обеспечить простоту внедрения и превосходную воспроизводимость от лаборатории к лаборатории.

Введение

Варианты лечения легочной болезни Mycobacterium abscessus (Mab) ограничены и включают в себя годичные схемы приема нескольких препаратов с пероральными, парентеральными и иногда ингаляционными антибиотиками, большинство из которых не обладают оптимальной бактерицидной активностью и связаны со значительной токсичностью 1,2,3,4,5 . Срочно необходимы более короткие, безопасные и эффективные методы лечения. Мышиные модели микобактериальных инфекций сыграли важную роль в открытии и оптимизации эффективных лекарств и схем приема лекарств 6,7. Тем не менее, доклиническая оценка антибиотиков против инфекций Mab оказалась сложной задачей из-за трудности установления прогрессирующих и устойчивых легочных инфекций у мышей 8,9.

Инфицирование иммунокомпетентных линий мышей Mab в значительной степени приводит к транзиторной колонизации с последующим быстрым клиренсом возбудителя10,11. Для достижения хронической инфекции, наблюдаемой клинически, иммобилизующие агенты, такие как агароза или агар, были использованы для стимулирования персистенции и иммунопатологического ответа на условно-патогенные микроорганизмы, такие как Pseudomonas aeruginosa или Haemophilus influenza у иммунокомпетентных мышей 12,13,14. Эта модель была недавно адаптирована для достижения хронической респираторной инфекции с помощью Mab ATCC 19977 на иммунокомпетентных мышах C57BL/6N 15,16,17,18. Метод индуцировал персистирующую инфекцию в течение 45 дней после интратрахеальной инокуляции ~1 × 104 до 1 ×10 6 колониеобразующими единицами (КОЕ), с частотой хронической инфекции среди инфицированных мышей 90%-100%19 и образованием организованных гранулем вокруг распадающегося шарика агара18. По-видимому, встраивание Mab в бусины защищает от быстрого выведения врожденной иммунной системой и что бусины, наполненные бактериями, представляют собой очаги для вербовки иммунных клеток, что приводит к образованию гранулем и возникновению хроническойинфекции. Шарики агара/агарозы представляют собой относительно инертный биоматериал, который вызывает минимальные воспалительные реакции. Кроме того, шарики медленно распадаются, что позволяет избежать проблем с аллергическими реакциями на инородные тела или индуцированным фиброзом. Внутритрахеальная инфекция с использованием или без использования устройства для микрораспыления обеспечивает эффективное введение инокулюма в легкие 8,20,21 и воспроизводит клинический контакт и инфекцию лучше, чем внутривенная или интраназальная инокуляция.

Таким образом, модель имеет множество преимуществ. Тем не менее, это также сопряжено с некоторыми проблемами технического характера, а именно: (i) достижение воспроизводимого размера гранул, (ii) получение воспроизводимой бактериальной нагрузки в гранулах и (iii) обеспечение постоянной внутритрахеальной доставки инокулюма. Здесь мы предоставляем подробные протоколы для надежного достижения этих целей и обеспечения воспроизводимости от лаборатории к лаборатории.

Протокол

Все исследования на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию Национальных институтов здравоохранения с одобрения Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию NIAID (NIH), Бетесда, штат Мэриленд. Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в учреждениях. Все исследования с участием M. abscessus проводились в лаборатории с уровнем локализации биобезопасности 2.

1. Приготовление агаровой бусины, внедренной M. abscessus inoculum

  1. Получить предварительную культуру M. abscessus ATCC 19977 путем инокуляции 1,5 мл культуры оптической плотности (OD600) 1 (с использованием спектрофотометра) в 200 мл среды Middlebrook 7H9 с добавлением 0,05% (v/v) Tween 80, 0,5% (v/v) глицерина и 10% (v/v) обогащения альбумин-декстрозой-каталазой (ADC) Миддлбрука.
  2. Инкубируйте культуры в роликовой бутылке при температуре 37 °C в течение 24 ч до достижения средней фазы логарифма (наружный диаметр600 = 0,4-0,6).
  3. Суспензируйте 1,2 г соевого бульона Tryptic (TSB) в 40 мл ультрачистой воды и добавьте 0,6 г агара Difco до конечной концентрации 1,5%.
  4. Перелейте 60 мл тяжелого минерального масла в колбу Эрленмейера объемом 500 мл и стерилизуйте минеральное масло и триптический соевый агар (TSA) при 121 °C в течение 15 минут, затем уравновесьте при 50 °C в духовке.
  5. Возьмите образец 1 мл культуры и измерьте наружный диаметр600.
  6. Соберите клетки центрифугированием при 3700 г в течение 15 мин при 4 °C. Ресуспендируйте клетки в 4 мл 1x фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS) для достижения наружного диаметра600 , равного примерно 30.
  7. Смешайте 3 мл бактериальной суспензии с 27 мл расплавленного TSA, предварительно уравновешенного при 50 °C, в центрифужной пробирке объемом 50 мл. Быстро перемешайте с помощью вортекса или пипетирования.
  8. Осторожно влейте бактериально-агаровую смесь (30 мл) в 60 мл минерального масла и поместите колбу во вторичную емкость. Быстро установите смесь на среднюю скорость (420 об/мин) на магнитной мешалке, установленной на 50 °C, с помощью магнитной мешалки. Следите за тем, чтобы в масляно-агаровой смеси образовался видимый вихрь. Перемешивайте в течение 6 минут при комнатной температуре (RT).
  9. Охладите смесь, положив лед во вторичную емкость, и продолжайте помешивать в течение 35 минут.
  10. Прекратите помешивание и дайте агаровой суспензии отдохнуть в течение 20 минут (при необходимости пополняйте лед).
  11. Перелейте смесь суспензии в две центрифужные пробирки объемом 50 мл и промойте 10 раз одним объемом DPBS для удаления масла и свободных бактерий (3700 г, 6 мин, 4 °C, в течение первых 5 циклов).
    1. Соедините суспензии шариков агара в одну трубочку на третьей промывке. Во время первых 5 циклов стирки используйте серологическую пипетку, чтобы аккуратно суспендировать бусины.
    2. Для последующих 5 циклов стирки используйте следующие параметры центрифугирования: 2000 г в течение 5 минут, затем 1000 г в течение 4, 3, 2 и 2 минут соответственно.
  12. Суспендируйте шарики агара в DPBS до конечного объема 40 мл, переложите в стерильный флакон объемом 125 мл и разбавьте в 4 раза, добавив 120 мл DPBS.
  13. Пропустите суспензию через сетчатое фильтр 200 мкм.
    1. Прикрепите ситечко к стерильной центрифужной пробирке объемом 50 мл. Затем добавьте образец материала на ситечко и отфильтруйте суспензию шариков.
    2. Чтобы облегчить процесс фильтрации, объедините сетчатое фильтр для клеток, воронку, соединительное кольцо и пробирку объемом 50 мл в одно устройство. Соберите детали в порядке воронки, клеточного фильтра, соединительного кольца и трубки объемом 50 мл и медленно потяните за поршень шприца объемом 30 мл, прикрепленного к соединительному кольцу.
  14. При необходимости промойте ситечко с противоположной стороны с помощью DPBS, чтобы смыть остатки более крупных шариков. Разбавленную суспензию сконцентрировать, вращая при 1000 г в течение 2 минут или давая шарикам осесть под действием силы тяжести. После сбора урожая бусины из агара хранить при температуре 4 °C до 1 недели. Для каждой партии экспериментов рекомендуется свежая подготовка.
  15. Пипеткой нанесите 5 л суспензии шарика на предметное стекло, накройте его защитным стеколом и сделайте снимки в нескольких случайных положениях с помощью светового или флуоресцентного микроскопа с объективом 10×. Сохраните изображения и измерьте диаметр валика с помощью ImageJ (желаемый диапазон размеров: 200 ± 50 мкм).

2. Титрование агаровых шариков, внедренных M. abscessus inoculum

  1. Добавьте 1 мл суспензии шариков в М-пробирку и асептически гомогенизируйте для высвобождения бактерий, встроенных в гранулы, с помощью диссоциатора, установленного на заранее заданную программу RNA.02.01.
  2. Возьмите 100 мкл гомогената и последовательно разбавьте от 1:10 до 1 × 10-5 разведения. Разбавления на агаре 7H10 с добавлением 10% олеиновой кислоты-альбумин-декстрозы-каталазы (OADC) и 2% глицерина. Перечислите КОЕ через 3-5 дней инкубации.
  3. При необходимости отрегулируйте титр инокулюма. Например, если каждая мышь получает 100 мкл суспензии в гранулах, содержащей 1 ×10 5 КОЕ, на 10 мышей, всего готовят 2 мл суспензии, содержащей 1 ×10 6 КОЕ/мл, плюс ~25% для учета потерь в шприцах.

3. Тестирование дозирования шариков через шприц и иглу

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги были включены для того, чтобы шарики не прилипли к поверхности шприца или иглы. Было установлено, что важно использовать стеклянный шприц и металлическую подающую иглу 24 Г, чтобы предотвратить потерю бусин из-за прилипания к пластиковым поверхностям.

  1. Приготовьте PBST, добавив 1,25 мл стерильного Tween от 80 до 500 мл стерильного PBS.
  2. Добавьте 900 мкл PBST в пять М-пробирок для тестирования шариков агара, проходящих через подающую иглу, а также 900 мкл PBST в 2-мл стерильных пробирок для приготовления от -2 до -6 разведений каждого проталкиваемого образца.
  3. Смешайте приготовленную ранее бусину с добавлением M. abscessus с помощью пипетки P1000, чтобы убедиться, что все шарики равномерно распределены.
  4. Прикрепите к стеклянному шприцу металлическую подающую иглу массой 24 г и аспирируйте агаровую суспензию, следя за тем, чтобы не образовывались пузырьки воздуха.
  5. Как только шприц заполнится без пузырьков воздуха, поместите нейлоновые зажимы или пробки на поршень шприца так, чтобы между зажимами не было места. Пробки обеспечивают точное дозирование 50-100 μл. Есть возможность установить до 6 зажимов вдоль плунжера.
  6. Выдавите 100 μL шариков («проталкивающих») в пробирки M в соответствующем порядке.
  7. После того, как будет собрано 5 проталкиваний, гомогенизируйте шарики с помощью диссоциатора тканей, настроенного на настройку РНК.02.01, адекватного для получения РНК из замороженных органов и который, как было обнаружено, эффективно высвобождает M. abscessus из гранул, не влияя на жизнеспособность клеток.
  8. Выполняйте серийное разведение гомогенатов в диапазоне от -1 до -6. Планшеты для разведения на агаровых пластинах 7H11 с добавлением OADC. Посчитайте КОЕ через 5 дней.

4. Внутритрахеальная инокуляция мышей

  1. Подготовьте мышей CD-1 в возрасте от 6 до 8 недель.
  2. Усыпляйте мышей с помощью системы воздействия изофлурана аэрозолем со скоростью потока 1-5%, как описано ранее1.
  3. Удерживайте мышей с помощью трехмерной (3D) напечатанной наклонной подставки (специально разработанной и изготовленной). Стержень в центре подставки имеет шовную веревку, которая удерживает мышь вертикально за резцы, помещая мышь в брюшное лежачее положение с поднятой головой.
  4. Прикрепите металлическую иглу для кормления животных 24 г к стеклянному шприцу, наполненному шариком агара, в который вкраплен M. abscessus. Поместите нейлоновые зажимы или пробки на поршень шприца, чтобы заразить каждую мышь 50 μл инокулюма.
  5. После того, как мышь под действием седативных препаратов будет зафиксирована на шве, переместите язык в сторону рта с помощью аппликатора ватной палочки.
  6. Визуализируйте заднюю часть рта мыши, чтобы четко определить белую часть в задней части рта и нацелиться на трахею мыши.
  7. Наклоните металлическую иглу для зонда вертикально над мышью и вставьте ее в верхнюю часть трахеи. При прохождении через надгортанник может наблюдаться небольшое сопротивление.
  8. Вставьте иглу зонда вниз в трахею, снимите нейлоновый зажим или пробку и выдавите 50 мкл агарового шарика, встроенного в M. abscessus.
  9. Дайте мышке отдохнуть 5 минут и повторите шаги 4.2-4.8 второй раз. Целью двухэтапной процедуры инокуляции является обеспечение воспроизводимого и глубокого осаждения полного инокулюма в легком.
  10. Дайте инфекции прогрессировать в течение 24 часов, после чего мышь усыпляют для перечисления отложений бактерий в легких.

Результаты

Размер и нагрузка борта
Чтобы визуализировать агаровые гранулы и их бактериальную нагрузку, красный флуоресцентный белок mCherry экспрессировали под конститутивным промотором Hsp60 в штамме типа Mab ATCC 19977 и встраивали этот штамм в агаровые гранулы, как описано выше. На рисунке 1А показан диапазон размера валика (масштабная линейка = 200 мкм). На рисунке 1B показана нагрузка на 6 независимых препаратов валика, демонстрируя воспроизводимость описанной процедуры.

Нанесение покрытия на шприц, проталкивание и бактериальная имплантация после внутритрахеального посева
Внутритрахеальная инокуляция была оптимизирована в два этапа. КОЕ/мл подсчитывали в инокулюменте до и после прохождения через стеклянный шприц, чтобы гарантировать отсутствие потерь гранул или бактерий при прохождении шариков через шприц и подключенную трубку. В таблице 1 показан начальный бактериальный титр двух независимых препаратов в гранулах (испытания 1 и 2) и количество извлеченных КОЕ на 100 мл «продавленных» образцов из одной загрузки шприца. Чтобы избежать потерь шариков и бактерий, необходим стеклянный шприц, соединенный с металлической трубкой. Бусины агара имеют тенденцию прилипать к пластиковым поверхностям.

Подсчет КОЕ с течением времени в препарате гранул показал, что бактериальная нагрузка гранул оставалась стабильной на уровне 4 °C в течение 1 недели, с ~2-кратной потерей бактериальной нагрузки за 2 недели и ненарушенным отложением в легких. Затем группы от 5 до 8 мышей были инфицированы тремя независимыми препаратами гранул, чтобы проверить воспроизводимость процедуры внутритрахеальной инокуляции. В таблице 2 показано количество КОЕ в легких на одну мышь, перечисленное через 24 часа после заражения, как описано.

Наконец, межоператорная воспроизводимость инфекции оценивалась путем инфицирования трех групп по 10 мышей CD-1, каждая из которых выполнялась разными операторами. КОЕ в легких, перечисленные через 24 ч после заражения, показаны на рисунке 2.

figure-results-1
Рисунок 1: Пилотный эксперимент для оценки размера гранул, визуализации и количественного определения бактериальной нагрузки M. abscessus . (A) Бусины агара, содержащие штамм M. abscessus ATCC 19977, сконструированы для экспрессии флуоресцентного белка mCherry red под конститутивным промотором hsp60. Пять μл суспензии в гранулах наносили на предметное стекло и визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного камерой (объектив 10x). Каждая красная точка представляет собой флуоресцентную бактериальную клетку, заключенную в шарики агара диаметром от ~70-250 мкм. (B) Бактериальная нагрузка в КОЕ/мл 6 отдельных препаратов гранул показывает воспроизводимость метода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Межоператорная воспроизводимость инфекции. Группы из 10 самок мышей CD-1 интрахеально инфицировались тремя независимыми операторами, как описано, с использованием одного и того же препарата в гранулах. Показаны перечисленные КОЕ в легких через 24 ч после заражения. O1, O2, O3: операторы 1, 2 и 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

КОЕ/100 μл
Подготовка швовПробное испытание 1Испытание 2
1.13Э+052.40Э+05
Образец для проталкивания шприца
11.14Э+055.10Э+05
21.36Э+054.10Э+05
39.30Э+043.90Э+05
49,80Э+043.60Э+05
51.14Э+05
Средний1.11Э+054.18Э+05
СД1.69E+04 (15%)6.50E+04 (16%)

Таблица 1: Колониеобразующие единицы (КОЕ) на 100 μл-образец после прохождения через стеклянный шприц и металлическую подающую иглу.

Пробное испытание 1Испытание 2Пробная версия 3
Идентификатор мышиКОЕ в легких/мышьИдентификатор мышиКОЕ в легких/мышьИдентификатор мышиКОЕ в легких/мышь
М-16.50Э+03М-62.20Э+05М-116.80Э+04
М-21.10Э+04М-72.70Э+05М-121.70Э+05
М-31.40Э+04М-88.10Э+04М-132.10Э+05
М-43.20Э+03М-91.40Э+05М-144.40Э+04
М-54.50Э+03М-101.30Э+05М-157.50Э+04
М-161.01Э+05
М-177.00Э+04
М-185.80Э+03
Средний7.84Э+03Средний1.68Э+05Средний9.30Э+04
СД4.54E+03 (58%)СД7.57E+04 (45%)СД6.67E+04 (72%)

Таблица 2: Имплантация шарика агара, внедренного M. abscessus , в легкие мыши через 24 часа после инокуляции

Обсуждение

Чтобы обеспечить равномерное распределение бактерий в шариках агара, важно равномерно взвесить расплавленную смесь агара и бактерий перед добавлением ее в масляную фазу. Объемное соотношение масла и агар-бактерий имеет решающее значение для контроля размера гранул. Более высокое соотношение масла к агару приводит к образованию более мелких шариков агара. При смешивании суспензии агар-бактерий с масляной фазой решающее значение имеет контроль температуры. Масляно-агаровая смесь должна быть достаточно теплой, чтобы обеспечить эмульгирование и образование капель, но достаточно холодной, чтобы не навредить бактериям. Непрерывное перемешивание при охлаждении смеси до комнатной температуры или ниже позволяет каплям агара образовываться и затвердевать.

Правильная калибровка перемешивающей пластины, размер мешалки, а также форма и размер колбы являются важными факторами, определяющими равномерность вихря. Перемешивающая планка, расположенная в центре колбы, создает симметричный вихрь, обеспечивая равномерное перемешивание. Смещенная от центра перемешивание полосы может привести к нестабильному вихрю, в результате чего бусины неправильной формы и появятся пузырьки воздуха в бусинах. Рекомендуется мониторинг и регулировка положения перемешивающей планки в режиме реального времени. Объем колбы должен быть пропорционален объему масляно-агаровой смеси. Колба объемом 500 мл идеально подходит для вращения масляно-агаровой смеси объемом 90 мл, создавая видимый вихрь. При использовании колб большего размера важно регулировать объем масляно-агаровой смеси, размер мешалки и скорость вихря, чтобы достичь баланса между эффективным перемешиванием и стабильным вихрем. Поддержание постоянной скорости завихрения во время процесса и при подготовке сварного шва имеет решающее значение для воспроизводимости от партии к партии.

Процесс приготовления агаровых шариков, в частности, скорость вихревого движения и соотношение масла-агара, адаптированы из16,22 с незначительными изменениями. Поперечные силы внутри вращающегося вихря по своей природе приводят к образованию бусин разных размеров. Чтобы свести к минимуму эту изменчивость размера, стадия сбора бусин была модифицирована путем введения нескольких стадий промывки, используя градиент уменьшающейся скорости центрифугирования и времени для обеспечения удаления мелких гранул (и свободных бактерий). Микросетчатый фильтр был использован для обогащения гранул желаемого размера, эффективно отфильтровывая более крупные гранулы и те, которые могли образоваться в результате случайной коалесценции. Чтобы избежать потерь шариков или бактерий при прохождении суспензии через шприц и подключенную трубку для внутритрахеального инокуляции мыши, крайне важно использовать стеклянный шприц, металлические подающие иглы 24 G и металлическую трубку.

Основным ограничением метода является техническая сложность подготовки шариков и внутритрахеального инокуляции для достижения воспроизводимой нагрузки на шарики и имплантации легких. Требуется внимание к деталям и умение устранять неполадки. Кроме того, модель не была полностью проверена путем тестирования эффективности стандартных антибиотиков и наиболее частых комбинаций антибиотиков, назначаемых пациентам с Маб.

В настоящее время ни одна мышиная модель хронической инфекции Mab не была валидирована до такой степени, чтобы эффективность отдельных агентов и комбинаций лекарств у пациентов можно было обоснованно предсказать с помощью модели9. Мышиная система C57BL/6, встроенная в агаровые шарики, была использована для проверки эффективности антимикробной терапии 15,19,23. Ближайшей альтернативой мышиной системе C57BL/6 со встроенными в бусины агарами является мышиная модель C3HeB/FeJ, которая полагается на иммуносупрессию дексаметазона для достижения длительной хронической инфекции24,25. Преимущества описанного здесь протокола заключаются в том, что (i) можно использовать полностью иммунокомпетентных и наиболее доступных мышей C57BL/6, (ii) продуктивная и хроническая инфекция может быть получена с помощью хорошо охарактеризованного типового штамма ATCC 19977, и (iii) отсутствует потребность в химически индуцированной иммуносупрессии, что позволяет избежать необходимости ежедневных инъекций дексаметазона, тем самым избегая потенциальных лекарственных взаимодействий и влияния на иммунопатологию легких.

Учитывая отсутствие валидированных мышиных моделей хронической инфекции Mab для оценки новых кандидатов в лекарства и схем приема лекарств 8,9, описанный здесь метод может продвинуть эту область вперед, повысить прогностическую ценность данных о доклинической эффективности, помочь определить приоритеты схем лечения с наибольшим потенциалом для обеспечения долгосрочного лечения и в целом ускорить открытие и разработку лекарств для лечения болезни легких Mab. Метод может быть применен к другим патогенам легких и имеет установленный послужной список для P. aeruginosa или Haemophilus influenza. Основная цель описанного здесь протокола заключается в предоставлении достаточных подробностей и рекомендаций для обеспечения простоты реализации и превосходной воспроизводимости от лаборатории к лаборатории.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов

Благодарности

Эта работа была профинансирована Фондом муковисцидоза, присуждением DICK24XX0, TD и VD, и R01-AI132374 от NIH-NIAID TD и VD.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бутылка объемом 125 млCorning8388стерильная
3 x 3 тубы для держания тубыFisher5972-0030PKПродезинфицирована перед использованием
3D-печатная подставка для мышиTransworld Marketing Специально разработан и изготовленПродезинфицирован перед использованием
48-луночный планшет для разбавленияCelltreat 229192Стерильные
центрифужные пробирки объемом 50 млGreiner Bio-One227261Стерильная
машина для лечения анестезииE-Z SystemsEZ-AF9000 SYSTEMn/a
Avanti J-15R Бекман Коултер  B99517Барьерные
наконечники для пипеток центрифуги в штативе с подъемной крышкой 1000GThermo Scientific ART 21-236-2AСтерильный
пакет для биологически опасных веществFisherbrand22-044561
Соединительное кольцо pluriSelect41-50000-03
Аппликаторы с хлопчатобумажными наконечникамиPuritan 22-029-571Стерильные
одноразовые петли для прививки Yellow Sterile 100 в пакете с застежкой-молниейCole-Parmer Essentials 03-391-562Стерильное
одноразовое полотенце с полиподкладкойDynarex19-310-671Стерильное
Фосфатно-солевой буфер Dulbecco'sScientific21-031-CMСтерильная
воронкаpluriSelect42-50000Стерильная
GE Ultrospec 10Sigma-AldrichGE80211630Спектрофотометр
Gentlemacs Диссоциатор тканейMiltenyi Biotec130-096-427Не активированный термией
шприц Hamilton Гамильтон 80801Продезинфицировано перед применением
Тяжелое минеральное маслоSigma-Aldrich330760-1LСтерильный
раствор изофлурана 250 мл флаконCovetrus29405Коррозия/раздражение кожи: Категория 2, Серьезное повреждение глаз/Раздражение глаз: Категория 2A, Специфическая системная токсичность для органов-мишеней (однократное воздействие): Категория 3
Может вызывать сонливость и головокружение, Вызывает серьезное раздражение глаз, Вызывает раздражение кожи. Не вдыхать, использовать в хорошо проветриваемом помещении.
Трубки M (gentleMACS)Miltenyi Biotec130-096-335Стерильная
магнитная мешалка MR Hei-Connect Heidolph505-40000-13-1
Магнитная мешалкаThomas Scientific  1181L08Пипетка стерильная
механическая 100– 1000 &микро; Л Жильсон ПИПЕТМАН L FA10006MПеред применением продезинфицирована
механическая пипетка 20°ndash; 200 &микро; Л Жильсон ПИПЕТМАН L FA10003MGПродезинфицирована перед использованием
Металлическая игла для кормления животных 24 GBraintree ScientificN-VP 24G-1SДолжна быть стерилизована (автоклавирована)
Миддлбрук 7H10 АгарСигма-ОлдричM0303-500GСтерилизованный (автоклавированный)
Миддлбрук 7H11 АгарТермо ФишерR4554002Стерилизованный (автоклавный)
Миддлбрук 7H9 среднийБектон Дикинсон271310Стерилизованные (автоклавные)
Детали подставки для мышиTriMech Solutions SRV-AMS-FDMПродезинфицированный перед применением
Нерассасывающийся шелковый шовный материалFisher Scientific18020-50н/д
OADC Жидкое обогащение для использования с Middlebrook Media 500 млThermo Scientific Remel R450605Стерильные
PBS (10x), pH 7,4 Стерильные фильтрованные 500 млGibco70-011-044Стерильные
салфетки PeroxiguardPeroxigard29221н/д
Чашки Петри с прозрачной крышкой круглые 100 мм x 15 ммFisherbrand FB0875712Sterile
PluriStrainer 200 mmpluriSelect43-50200-03Sterile; cell sither
Roller bottlesCorning430165Sterile
Serological pipetteCorning4489Sterile
Spectrophotometer кюветы 1,5 млFisher Scientific14955127Sterilized (autoclaved)
Шприцевые пробки или зажимы (нейлоновые)Trimech SRV-AMS-MJFПродезинфицирован перед применением
Триптический соевый бульонSigma-AldrichT8907-500GСтерильный
твин 80 Fisher170793Фильтр стерилизованный 
Наконечники для пипеток с широким отверстием и фильтром, подъемная крышка, штатив 200G Thermo Scientific ART21-236-1AСтерильный
Thomas

Ссылки

  1. Dartois, V., Dick, T. Drug development challenges in nontuberculous mycobacterial lung disease: Tb to the rescue. J Exp Med. 219 (6), e20220445(2022).
  2. Martiniano, S. L., Nick, J. A., Daley, C. L. Nontuberculous mycobacterial infections in cystic fibrosis. Clin Chest Med. 43 (4), 697-716 (2022).
  3. Maurer, F. P., et al. Lack of antimicrobial bactericidal activity in mycobacterium abscessus. Antimicrob Agents Chemother. 58 (7), 3828-3836 (2014).
  4. Wu, M. L., Aziz, D. B., Dartois, V., Dick, T. Ntm drug discovery: Status, gaps and the way forward. Drug Discov Today. 23 (8), 1502-1519 (2018).
  5. Egorova, A., Jackson, M., Gavrilyuk, V., Makarov, V. Pipeline of anti-mycobacterium abscessus small molecules: Repurposable drugs and promising novel chemical entities. Med Res Rev. 41 (4), 2350-2387 (2021).
  6. Nuermberger, E. Using animal models to develop new treatments for tuberculosis. Semin Respir Crit Care Med. 29 (5), 542-551 (2008).
  7. Nuermberger, E. L. Preclinical efficacy testing of new drug candidates. Microbiol Spectr. 5 (3), (2017).
  8. Nicola, F., Cirillo, D. M., Lore, N. I. Preclinical murine models to study lung infection with mycobacterium abscessus complex. Tuberculosis (Edinb). 138, 102301(2023).
  9. Dartois, V., et al. Preclinical murine models for the testing of antimicrobials against mycobacterium abscessus pulmonary infections: Current practices and recommendations. Tuberculosis (Edinb). 147, 102503(2024).
  10. Obregon-Henao, A., et al. Susceptibility of mycobacterium abscessus to antimycobacterial drugs in preclinical models. Antimicrob Agents Chemother. 59 (11), 6904-6912 (2015).
  11. Lerat, I., et al. In vivo evaluation of antibiotic activity against mycobacterium abscessus. J Infect Dis. 209 (6), 905-912 (2014).
  12. Saliu, F., et al. Chronic infection by nontypeable haemophilus influenzae fuels airway inflammation. ERJ Open Res. 7 (1), (2021).
  13. Rodgers, A. M., et al. Biologically relevant murine models of chronic pseudomonas aeruginosa respiratory infection. Pathogens. 12 (8), 1053(2023).
  14. Hoover, J. L., et al. A robust pneumonia model in immunocompetent rodents to evaluate antibacterial efficacy against s. Pneumoniae, h. Influenzae, k. Pneumoniae, p. Aeruginosa or a. Baumannii. J Vis Exp. (119), e55068(2017).
  15. Lore, N. I., et al. The aminoglycoside-modifying enzyme eis2 represents a new potential in vivo target for reducing antimicrobial drug resistance in mycobacterium abscessus complex. Eur Respir J. 60 (6), 2201541(2022).
  16. Riva, C., et al. A new model of chronic mycobacterium abscessus lung infection in immunocompetent mice. Int J Mol Sci. 21 (18), 6590(2020).
  17. Chang, V., Phillips, P. P. J., Imperial, M. Z., Nahid, P., Savic, R. M. A comparison of clinical development pathways to advance tuberculosis regimen development. BMC Infect Dis. 22 (1), 920(2022).
  18. Yang, S. J., et al. Pathological granuloma fibrosis induced by agar-embedded mycobacterium abscessus in c57bl/6jnarl mice. Front Immunol. 14, 1277745(2023).
  19. Poerio, N., et al. Combined host- and pathogen-directed therapy for the control of mycobacterium abscessus infection. Microbiol Spectr. 10 (1), e0254621(2022).
  20. Pearce, C., et al. Inhaled tigecycline is effective against mycobacterium abscessus in vitro and in vivo. J Antimicrob Chemother. 75 (7), 1889-1894 (2020).
  21. De Groote, M. A., et al. Gm-csf knockout mice for preclinical testing of agents with antimicrobial activity against mycobacterium abscessus. J Antimicrob Chemother. 69 (4), 1057-1064 (2014).
  22. Facchini, M., De Fino, I., Riva, C., Bragonzi, A. Long term chronic pseudomonas aeruginosa airway infection in mice. J Vis Exp. (85), e51019(2014).
  23. Degiacomi, G., et al. The novel drug candidate vomg kills mycobacterium abscessus and other pathogens by inhibiting cell division. Int J Antimicrob Agents. 64 (4), 107278(2024).
  24. Rimal, B., et al. T405, a new penem, exhibits in vivo efficacy against m. Abscessus and synergy with beta-lactams imipenem and cefditoren. Antimicrob Agents Chemother. 66 (6), e0053622(2022).
  25. Maggioncalda, E. C., Story-Roller, E., Ammerman, N. C., Nuermberger, E. L., Lamichhane, G. Progressive mycobacterium abscessus lung infection in c3heb/fej mice associated with corticosteroid administration. bioRxiv. , (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи