Итеративное отбеливание расширяет возможности использования автоматизации окрашивания на основных объектах

Краткое содержание

В данной статье мы описываем применение метода Iterative Bleaching Extends Multiplicity (IBEX) с использованием коммерчески доступных автоматизированных окрашивателей тканей и соображения по оптимизации использования реагентов на основе усиления тирамидного сигнала.

Аннотация

Итеративное отбеливание продлевает множественность (IBEX) — это высокочувствительный метод многокруговой флуоресцентной визуализации на основе усиления тирамидного сигнала (TSA), позволяющий детально изучить многочисленные биомолекулы белка в одном образце ткани путем многократного отбеливания, повторного окрашивания и совместной регистрации изображений. Несмотря на растущее распространение IBEX для получения высокомультиплексного иммуноокрашивания, внедрение IBEX в автоматическом режиме путем развертывания на основных объектах дает множество преимуществ, включая повышенную пропускную способность, воспроизводимость и общую эффективность лабораторного персонала. В этой статье мы продемонстрируем успешное применение IBEX на двух широко используемых платформах автоокрашивателей и обсудим важные аспекты оптимизации дизайна панелей с использованием реакций на основе TSA для фиксированных формалином и залитых парафином (FFPE) образцов тканей. Это включает в себя методологию тестирования чувствительности к извлечению антител-антигенов, что является важным фактором для разработки панели IBEX при определении последовательности развития антител. Кроме того, мы демонстрируем нисходящие подходы к визуализации с использованием коммерчески доступных сканеров цельного предметного стекла и иллюстрируем выравнивание и анализ качества с помощью коммерчески доступного программного обеспечения для фенотипирования клеток. С помощью подробного описания этих методологий и сопроводительных видеороликов мы стремимся подчеркнуть универсальность и простоту IBEX, предлагая практические рекомендации для основных патологических учреждений по интеграции IBEX в их существующие автоматизированные платформы окрашивания.

Введение

Итеративное отбеливание продлевает множественность (IBEX) — это значительный шаг вперед в высокочувствительной многораундовой флуоресцентной иммуногистохимии на основе TSA, позволяющий детально визуализировать и количественно оценивать многочисленные биомолекулы в одном образце ткани. Используя повторяющиеся циклы отбеливания и повторного окрашивания, IBEX позволяет исследовать сложные клеточные среды с беспрецедентной глубиной и четкостью, что делает его мощным инструментом в области иммуноокрашивания и мультиплексной^{визуализации.}

Многие академические, правительственные и промышленные учреждения имеют основные патологические учреждения, предназначенные для поддержки разнообразного спектра методологий исследований на основе тканей, направленных на создание качественных и количественных наборов морфомолекулярных данных. Эти ядра являются критически важными ресурсами, предоставляющими специализированные тканевые услуги, которые позволяют исследовательским лабораториям передавать сложные и трудоемкие процессы молекулярной патологии на аутсорсинг и напрямую консультироваться с патологоанатомами при планировании исследований, разработке анализов и интерпретации данных. Чтобы обеспечить согласованность и снизить вариативность между экспериментами, эти основные установки обычно полагаются на коммерчески доступные автоокрашиватели — автоматизированные приборы, предназначенные для выполнения стандартизированных протоколов окрашивания с высокой воспроизводимостью и^{эффективностью}.

В то время как автокрасители стали основой иммуноокрашивания в основных учреждениях, обеспечивая высокую производительность и стабильные результаты, они еще не были адаптированы для более поздних достижений, таких как IBEX. Кроме того, потребность в специализированных знаниях в области проектирования панелей, особенно при использовании реагентов на основе усиления тирамидного сигнала (TSA)⁴, добавляет дополнительный уровень сложности, ограничивая более широкое внедрение IBEX в рутинные исследовательские рабочие процессы. В результате, исследователи, желающие воспользоваться возможностями мультиплексной визуализации IBEX с высоким разрешением, часто могут быть ограничены существующим оборудованием своих основных объектов. Этот разрыв между инновационными методами визуализации и практическими реалиями работы основного объекта подчеркивает препятствие на пути более широкого внедрения IBEX в академических исследованиях. Данная работа направлена на устранение этого барьера путем демонстрации успешного применения IBEX на распространенных платформах автоокрашивателей, уделяя особое внимание использованию реагентов на основе TSA с использованием фиксированных формалином и залитых парафином тканей (FFPE). Сначала мы обсудим шаги, необходимые для создания панели IBEX с использованием красителей на основе TSA, и нанесение покрытия этих панелей на два различных коммерчески доступных автоморилки. В совокупности это дает практическое руководство по тестированию чувствительности антител-антигенов, обсуждаются ключевые соображения по оптимизации конструкции панелей и предлагается альтернативный метод выравнивания панелей с использованием коммерческого программного обеспечения, которое может быть доступно и осуществляется в лабораториях основных патологоанатомических исследований.

Протокол

1. Сборка панелей IBEX с использованием красителей на основе TSA

ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте свежий препарат антител и красителей и храните при температуре 4 °C, когда они не используются.

1. Тестирование чувствительности к антигенам
   1. Подготовка слайдов
      1. С помощью микротома соберите три последовательных среза для каждого тестируемого антитела из одной и той же ткани, встроенной в FFPE, на три отдельных, положительно заряженных предметных стекла.
      2. Нанесите на этикетку предметные стекла с тестируемым антителом, а также с указанием количества тестовых циклов извлечения антигена: 1 цикл, 3 цикла и 6 циклов.
      3. Просушите горки в течение ночи при комнатной температуре. Если вы работаете только с поверхностными маркерами, выпекайте предметные стекла при температуре 60 ^°C не менее 20 минут, чтобы воск размягчился. Если вы работаете с ядерными маркерами, запекайте предметные стекла при температуре 60 ^°C в течение ночи.
   2. Подготовьте программу автопятнителя для разного количества циклов, следя за тем, чтобы между каждым этапом было три этапа стирки. В таблице 1 приведены примеры протоколов для тестов на 1, 3 и 6 циклов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого отдельного антитела обеспечьте одинаковое время для этапа введения антител и нанесения красителя TSA.
      Для нанесения красителя на основе TSA альтернативой тому, чтобы дать красителю постоять в течение 3-10 минут при комнатной температуре, является инкубация красителя в течение 20 минут при 37 °C.
   3. Загрузите образцы в автоокрашиватель и запустите протокол для соответствующего количества циклов.
   4. Повторите этот процесс, описанный на шагах с 1.1.1 по 1.1.3, для каждого отдельного антитела, подлежащего валидации и тестированию.
   5. Снимите слайды с автопятенатора и поместите их в PBS.
   6. Закрепите слайды с помощью водного монтажного носителя (так же, как для круглого IBEX) и покровного стекла #1.5 для оптимального изображения.
   7. Используйте эпифлуоресцентный микроскоп для получения изображения предметного стекла за 1 цикл для красителя TSA и DAPI, отмечая время воздействия, необходимое для визуализации сигнала.
   8. Повторите это для слайдов с 3 и 6 циклами, отмечая время воздействия, необходимое для визуализации красителя TSA.
   9. Сравнивайте время воздействия по разным номерам циклов. Примеры см. на рисунке 1 . Обеспечьте три цикла стирки между всеми этапами.
      1. Если время воздействия уменьшается с увеличением циклов, поместите это антитело и окрашивание на более поздний этап.
      2. Если время воздействия увеличивается с увеличением циклов, поместите это антитело на более раннюю стадию.
      3. Если нет больших изменений во времени воздействия, поместите это антитело на любом этапе.
      4. Группируйте антитела на основе требований к циклу для начального прохода на панелях IBEX.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов выполните эту проверку на всех желаемых маркерах для данной панели IBEX. Выполняйте эту валидацию каждый раз при изменении типов тканей или при работе с поликлональными первичными антителами с уникальными номерами партий.
2. Адресное просачивание сигнала от спектрально расположенного рядом красителя путем оценки силы сигнала.
   1. Группируйте антитела в потенциальные панели IBEX на основе оптимального числа циклов поиска, как было определено выше, в группы по 1, 3 или 6 циклов.
   2. Подготовка слайдов
      1. Используйте микротом для создания последовательных срезов из образца FFPE, по одному для каждого антитела для использования в одной панели IBEX.
      2. Пометьте каждое предметное стекло одним из антител, которые будут использоваться в панели IBEX.
      3. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи при комнатной температуре. Если вы работаете только с поверхностными маркерами, дайте предметным стеклам запечься при температуре 60 ^°C не менее 20 минут, чтобы размягчить воск. Если вы работаете с ядерными маркерами, дайте предметным стеклам запечься при температуре 60 ^°C в течение ночи.
   3. Для группы циклов 1, 3 и 6 используйте настройку одного цикла, приведенную в таблице 1. Обеспечьте три стирки между всеми этапами
      1. Измените протокол для каждого используемого антитела с оптимальным временем окрашивания.
      2. Используйте одно и то же время TSA для всех антител.
   4. Окрасьте образцы на автопятнире.
   5. Извлеките образцы и поместите слайды в PBS.
   6. Закрепите слайды с помощью водного монтажного носителя (так же, как для круглого IBEX) и покровного стекла #1.5 для оптимального изображения.
   7. Визуализируйте слайды на эпифлуоресцентном микроскопе, используя оптимальное время экспозиции для каждого изображения.
   8. Определение уровня сигнала. Слайды с коротким временем экспозиции имеют очень высокую мощность сигнала, в то время как слайды с длительным временем экспозиции имеют низкую мощность сигнала.
   9. Используйте уровень сигнала вместе с номером цикла для разработки панелей IBEX.
      1. Группируйте антитела на основе номера цикла.
      2. Для данной группы антител с определенным номером цикла убедитесь, что сильный сигнал оптически не близок к слабому сигналу, чтобы свести к минимуму распространение сигнала.
3. Проверьте отдельные панели IBEX, чтобы убедиться, что каждая панель может дать желаемый результат.
   1. Подготовьте горки.
      1. Используйте микротом для создания последовательных секций, по одному для каждой мультиплексной панели IBEX, и пометьте порядок используемых панелей IBEX.
      2. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи при комнатной температуре. Если вы работаете только с поверхностными маркерами, дайте предметным стеклам запечься при температуре 60 ^°C не менее 20 минут, чтобы размягчить воск. Если вы работаете с ядерными маркерами, дайте предметным стеклам запечься при температуре 60 ^°C в течение ночи.
   2. Настройте автопятенатор.
      1. Для первой панели настройте программу автоокрашивания без дополнительных действий по извлечению антигена.
      2. Для второй панели введите дополнительные этапы денатурации перед первым антителом, равные количеству стадий денатурации в первой панели. В таблице 2 приведен пример панели 1 с пятью антителами, а в таблице 3 приведен пример панели 2 с четырьмя антителами. Обеспечьте три этапа стирки между всеми этапами.
      3. Повторите при необходимости для дополнительных панелей IBEX, добавив больше этапов денатурации.
   3. Извлеките слайды из автопятнителя и поместите их в PBS до тех пор, пока они не будут готовы к установке.
   4. Закрепите слайды с помощью водного монтажного носителя (так же, как для круглого IBEX) и покровного стекла #1.5 для оптимального изображения.
   5. Визуализируйте слайды на эпифлуоресцентном микроскопе, используя оптимальное время экспозиции для каждого изображения и каждого красителя TSA.
   6. Оцените, все ли панели отображаются правильно. Если это так, переходите к визуализации IBEX. Если нет, переадресуйте циклы балансировки и извлечения сигнала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые настройки могут быть выполнены в пределах одной панели для оптимизации сигнала и предотвращения «эффекта зонтика». Некоторые очень распространенные сигналы могут блокировать окрашивание нисходящих сигналов. Сначала загляните внутрь данной панели, чтобы использовать более редкие пятна (см. рис. 2).

2. Адаптация IBEX с помощью автоокрашивателей с использованием реагентов TSA и платформ для визуализации всего предметного стекла (Рисунок 3)

ПРИМЕЧАНИЕ: Сравнение двух валидированных автокрасителей, используемых и обсуждаемых в этом протоколе, см. Таблицу 4.

1. Подготовьте все слайды для прогона IBEX.
   1. Используйте микротом для создания секций FFPE на положительно заряженном слайде. Обязательно включите один слайд для каждого экспериментального образца, положительные контрольные слайды срезов тканей, которые, как известно, содержат антигены, подлежащие визуализации, и отрицательный контрольный слайд, в котором PBS используется вместо всех первичных антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы работаете в пакетах, включите контрольный образец партии. Контрольный образец партии представляет собой один блок ткани FFPE, который разрезается и включается в каждую партию экспериментальных образцов для использования в нормализации и контроле экспериментальных вариаций между партиями окрашиваемых образцов. Это необходимо только в том случае, если не все образцы будут обрабатываться вместе.
   2. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи при комнатной температуре. Если вы работаете только с поверхностными маркерами, дайте предметным стеклам запечься при температуре 60 ^°C не менее 20 минут, чтобы размягчить воск. Если вы работаете с ядерными маркерами, дайте предметным стеклам запечься при температуре 60 ^°C в течение ночи.
2. Подготовьте антитела и красители для первой панели IBEX, которая будет визуализирована.
3. Настройте программу автоокрашивания. В таблице 2 приведен пример панели с 5 маркерами. Обеспечьте три стирки между каждым этапом.
4. Загрузите образцы и антитела в автоокрашиватель и запустите программу для окрашивания образцов.
5. Снимите предметные стекла с автопятенизатора и наклейте покровное стекло с помощью водного монтажного материала, подходящего для мультиспектральной визуализации, и покровного стекла #1.5.
6. Сфотографируйте предметные стекла в течение 2 дней после окрашивания
7. Флуоресцентная визуализация на эпифлуоресцентном или флуоресцентном сканере слайдов
   1. Начиная с хорошо контролируемого положительного контрольного образца, загрузите положительный контрольный образец в микроскоп.
      1. Найдите положительный сигнал в образце для каждого из различных антигенов, которые необходимо визуализировать.
      2. Установите время экспозиции, чтобы обеспечить захват динамического диапазона пятна при минимизации фона, начав с низкой экспозиции и постепенно увеличивая время экспозиции до появления сигнала. Делайте это для каждого красителя индивидуально.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте наличие как высокой, так и низкой экспрессии маркеров, чтобы обеспечить захват полного динамического диапазона.
   2. Сохраните настройки, использованные для положительного контрольного образца, и используйте их для всех дальнейших этапов визуализации.
   3. Загрузите и изобразите отрицательный контрольный образец и все экспериментальные образцы с настройками, определенными положительным контрольным образцом.
   4. Убедитесь, что изображения имеют оптимальное качество, прежде чем переходить к следующим шагам.
8. Снятие покровного стекла
   1. Погрузите предметные стекла в банку Coplin с деионизированной водой. Поместите банку Coplin на водяную баню при температуре 65 °C на 15-20 минут, чтобы облегчить естественное снятие покровного стекла. В качестве альтернативы, если используется монтажный материал на водной основе или монтажный материал полностью затвердел, удалите покровные стекла, замочив их в фосфатно-солевом буфере (PBS) или деионизированной воде на ночь, чтобы покровные стекла могли отвалиться естественным образом.
9. Отбеливание с помощью LiBH₄
   1. В вытяжном шкафу приготовьте свежий раствор LiBH₄ в концентрации 1 мг/мл в деионизированной воде. Сделайте достаточно, чтобы покрыть каждый образец 3 раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не готовьте более 10 мл за один раз из-за реакции LiBH₄ с водой. Используйте деионизионную воду, а не многопоровую/наночистую воду для оптимального отбеливания.
   2. Дайте раствору отдохнуть 20 минут. Будут образовываться пузыри.
   3. Нанесите пипеткой 1 мл раствора LiBH₄ на каждое предметное стекло в камере окрашивания в вытяжном шкафу. Дайте раствору отдохнуть на предметном стекле в течение 10-15 минут.
   4. Извлеките LiBH₄ с помощью пипетки со предметного стекла и замените его свежим 1 мл LiBH_4. Дайте раствору отдохнуть 10-15 минут.
   5. Извлеките LiBH₄ с помощью пипетки со предметного стекла и замените его свежим 1 мл LiBH_4. Дайте раствору отдохнуть 10-15 минут.
   6. Извлеките LiBH₄ из предметных стекол с помощью пипетирования и погрузите предметные стекла в деионизионную воду или PBS для кратковременного хранения (не более 1 суток).
   7. В течение дня переходите к следующему раунду окрашивания IBEX.
   8. Дополнительно: влажные слайды и быстрая визуализация на эпифлуоресцентном эндоскопе для проверки успешности отбеливания.
10. Мокрое крепление ползуна в автоокрашиватель и второй прогон окрашивания IBEX
    1. Приготовьте все антитела и растворы красителя TSA для автокрасителя.
    2. Для автокрасителя Ventana:
       1. Когда вы будете готовы начать автоматическое окрашивание, нанесите пипеткой примерно 1 мл буфера для промывки автоокрашивателя на предметное стекло, чтобы предотвратить высыхание влажного крепления.
       2. Загрузите в автопятнитель салазки с мокрым креплением.
    3. Для Bond Rx:
       1. Разместите покровную плитку на горках.
       2. В верхней части покровного покрытия нанесите пипетку объемом 300 мкл промывочного буфера, чтобы раствор мог стекать в пространство между образцом и покровным покрытием.
       3. Загрузите образцы в автопятнитель.
    4. Настройте программу автоокрашивания по примеру в таблице 2 , установив N на количество антител в панели.
    5. Снимите предметные стекла с автопятенизатора и наклейте покровное стекло с помощью водного монтажного материала, подходящего для мультиспектральной визуализации, и покровного стекла #1.5.
    6. Визуализируйте предметные стекла в течение 2 дней после окрашивания, следуя процедуре отбора образцов, описанной в шаге 2.7 для настройки сеанса визуализации и сбора изображений.
    7. После визуализации отбеливайте образцы, как описано в шагах 2.8-2.9.
11. Повторите для всех желаемых панелей IBEX.

3. Анализ образцов с помощью коммерчески доступного программного обеспечения

1. Завершите сканирование всех слайдов с пятнами перед тем, как приступить к совмещению.
2. Если программное обеспечение позволяет, выполните расмешивание спектров с помощью встроенной в функции сканирования функции автоматического расмешивания, включая удаление спектров автофлуоресценции. Если это функция используемого программного обеспечения, выберите опцию отмены смешивания и запустите с использованием стандартных настроек и предустановленных красителей
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пользовательское немикширование может быть сгенерировано в большинстве программ, которые позволяют выполнять несмешивание. Чтобы создать библиотеку, отдельные срезы ткани, окрашенные одним флуорофором, добавляются к измерениям программного обеспечения. Область неокрашенной или автофлуоресцентной ткани также сканируется для определения характеристик спектра автофлуоресценции, и он выбирается с помощью инструмента автофлуоресценции. Эти спектры компилируются внутри программы путем нажатия кнопки "подготовить изображение", а затем экспортируются в библиотеку для конкретного проекта. Затем эта библиотека выбирается в качестве библиотеки для восстановления смешивания в опции восстановления микширования.
3. Импортируйте отсканированные слайды в коммерчески доступное программное обеспечение для анализа изображений для выравнивания.
4. Регистрация слайдов нескольких раундов IBEX
   1. Выберите две итерации раундов IBEX, которые будут зарегистрированы.
   2. Щелкните правой кнопкой мыши по двум и выберите опцию «Регистрация ».
   3. Выберите регистрацию по умолчанию с регистрацией с высоким разрешением для первоначальной попытки регистрации.
   4. Кроме того, выберите «Регистрация по одному каналу » из предложенных вариантов и выберите один канал, который был согласован во всех прогонах IBEX.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта опция полезна для красителей, устойчивых к отбеливанию (см. материалы, для которых красители не отбеливаются).
5. Выравнивание изображений
   1. Откройте одно из зарегистрированных изображений.
   2. На вкладке «Инструменты » в разделе «Регистрация изображений» выберите «Средства регистрации », чтобы открыть все зарегистрированные изображения.
   3. Во вкладке Инструменты регистрации выберите функцию ориентира.
   4. Используйте функцию ориентира для точной настройки выравнивания целых слайдов.
      1. Отметьте ориентиры на одном слайде вручную.
      2. На других изображениях IBEX отметьте тот же ориентир. Программа будет уточнять трассу с использованием выявленного ориентира. Повторите эти действия для точной настройки выравнивания.
   5. После того, как вы будете удовлетворены выравниванием, соедините слайды с помощью кнопки Fuse | Функция серийного окрашивания.
   6. Повторите этот процесс с любыми дополнительными раундами визуализации IBEX, пока не будет завершена окончательная композиция всех изображений.
6. Анализ изображений
   1. Сегментация клеток
      1. На вкладке Анализ выберите и откройте модуль HighPlex, а затем выберите модуль фенотипирования для идентификации клеток.
         1. Загрузите все маркеры и начните с поиска всех ядер с помощью вкладки «Обнаружение ядра » в модуле Highplex . Загрузите маркеры на вкладке «Выбор красителя ». Идентифицируйте клетки с помощью красителя DAPI.
         2. На вкладке Анализ включите инструмент Настройка в реальном времени , используя следующие ключевые параметры: Минимальная интенсивность ядерного излучения, установленная для фильтрации фонового сигнала; Максимальная яркость изображения установлена для управления общей видимостью сигнала; Агрессивность ядерной сегментации, предназначенная для уточнения границ обнаруженных ядер.
         3. Тщательно настраивайте каждый параметр, чтобы обеспечить точную сегментацию.
   2. Обнаружение цитоплазматических и мембранных маркеров.
      1. Перейдите на вкладку «Обнаружение мембран и цитоплазмы ».
      2. Установите минимальный радиус цитоплазмы на значение, подходящее для образца и ожидаемого размера клеток.
      3. В параметре «Мембранные красители » укажите, какие каналы являются мембранными маркерами.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно привести к лучшей сегментации отдельных клеток для дальнейшего анализа.
   3. Пороговое определение маркеров и присвоение фенотипов
      1. Для каждого маркера установите пороговые значения для положительных и отрицательных сигналов. Сделайте это под вкладками, созданными для каждого маркера.
      2. Выполните ручное определение пороговых значений для каждого маркера, чтобы идентифицировать популяции.
      3. В качестве альтернативы можно использовать автоматизированный подход к установлению пороговых значений, основанный на биоинформатике. В расширенном | Хранить данные объекта (ячейки) в положение True. В разделе Экспорт | Object Data, экспортируйте набор данных, чтобы получить информацию о выражении маркера для каждой идентифицированной ячейки.
      4. Импортируйте эти данные в дополнительное программное обеспечение для дальнейшего индивидуального анализа. Варианты программного обеспечения для дальнейшего анализа приведены в таблице 5.

Результаты

Приведем пример панели IBEX с использованием реагентов на основе TSA на Autostainer 2 (рис. 4). Каждый маркер может быть четко очерчен, а просвечивание между маркерами минимально. Изображение было собрано с помощью двух раундов окрашивания. Образец представляет собой легочную ткань после инфицирования Mycobacterium tuberculosis. Две окрашивающие панели IBEX были выровнены с использованием примера коммерчески доступного программного обеспечения. Используя подход IBEX с оптимизированными реагентами TSA (как описано здесь), можно увидеть и оценить пространственную организацию иммунных клеток, маркеров воспаления и специализированных клеток легких. Правильная оптимизация позволяет легко отображать маркеры с минимальным фоном.

Рисунок 1: Тестирование на извлечение антигена с помощью флуорофора с излучением 520 нм двух различных антигенов. RAGE и CD3e были визуализированы с использованием консервативного времени экспозиции. Эпитоп этого антитела RAGE обладает высокой чувствительностью и восприимчив к повторному извлечению антигена с быстрым снижением чувствительности анализа с последующим извлечением антигена. И наоборот, чувствительность анализа CD3e улучшается при многократном отборе антигена. Масштабные линейки = 50 μм. Сокращение: RAGE = рецептор для конечных продуктов гликирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Пример важности разработки последовательности по отношению к зонтичному эффекту. RAGE является высокоэкспрессированным маркером в клетках AT1 и в сочетании с CD31 эффективно блокирует иммунореактивность SARS-CoV-2. Однако, когда сначала проводится ИГХ SARS-CoV-2, все сигналы можно визуализировать. Масштабные линейки = 25 μм. Сокращения: RAGE = рецептор для конечных продуктов продвинутого гликирования; AT1 = альвеолярный тип 1; SARS-CoV-2 = коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2; ИГХ = Иммуногистохимия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Обзор процесса с использованием автоматизированного оборудования для окрашивания по протоколу IBEX. Влажный монтаж для раунда 2 или выше процесса окрашивания, чтобы предотвратить высыхание ткани. Аббревиатура: IBEX = Итеративное отбеливание расширяет кратность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Пример IBEX с красителями на основе TSA из аутостейнера 2 на легком, инфицированном Mycobacterium tuberculosis. Панель 1 содержит все красители, а панель 2 содержит красители, которые поддаются отбеливанию. Представлено объединенное изображение всех каналов по всему КОЗЫРНОМУ козырному козырьку изображения легких. Масштабные линейки = 200 мкм. Сокращения: IBEX = итеративное отбеливание расширяет кратность; TSA = усиление тирамидного сигнала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Пример протокола для валидации влияния номера цикла на антитела для тестов 1, 3 и 6 циклов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Пример панели 1 с пятью антителами для автоокрашивателя IBEX для валидации панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Пример панели 2 с четырьмя антителами для автоокрашивателя IBEX для валидации панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 4: Сравнение двух автопятен. Таблица, обобщающая плюсы и минусы Ventana Autostainer и Bond Rx. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 5: Резюме программного обеспечения для анализа изображений. Таблица, обобщающая некоторые подходы к анализу и программные инструменты, доступные для анализа изображений после сегментации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

В данной статье мы предлагаем рекомендации по адаптации протокола IBEX к основным патологоанатомическим учреждениям с применением автоматизированного оборудования для окрашивания и оптимизации реагентов на основе TSA в протоколе IBEX. Мы демонстрируем, как наилучшим образом оптимизировать повторные раунды извлечения антигена и надлежащую загрузку в раунде 2 или выше на автоматизированное оборудование. Кроме того, мы демонстрируем дополнительный метод выполнения юстировки с помощью программного обеспечения Halo, которое может быть доступно на основных объектах. Эти подходы доказали свою полезность при определении различий в легочной среде в тканях приматов после инфекций SARS-CoV-2⁵.

Ключевым компонентом этой работы является выявление необходимости обширной оптимизации конструкции панели IBEX перед окрашиванием экспериментальных тканей. В частности, при использовании реагентов на основе TSA необходимо учитывать некоторые соображения, не наблюдаемые в базовых методах IBEX. Во-первых, это влияние нескольких раундов извлечения антигена на чувствительность антител. При использовании реагентов на основе TSA каждой новой разработке антитела предшествует денатурация антител. Некоторые пары антитела/антигены будут чувствительны к дополнительным раундам забора антигена и уменьшат чувствительность анализа, в то время как некоторые получат повышенную чувствительность при повторной денатурации/извлечении антигена. Тщательное тестирование каждого антитела в целевой ткани перед проектированием панелей важно для обеспечения наилучших методов окрашивания и информирования о порядке последовательности как антител, так и флуоресцентных красителей. Буферы, в том числе на основе цитрата (pH 6,0) и Tris-EDTA (pH 9,0), тестируются на все антитела для определения оптимальных условий извлечения антигена. Это включает в себя систематическую оценку каждого буфера для определения того, какой из них максимизирует воздействие антигена для данного антитела. Кроме того, температура (например, 20-37 °C), время инкубации (обычно 30-60 минут) и условия блокирования оптимизируются для снижения неспецифического фонового окрашивания и обеспечения специфического связывания первичных и вторичных антител, если это необходимо. Блокирование перед первичными и вторичными антителами может включать использование коммерчески доступных блокирующих реагентов для учета тканеспецифической автофлуоресценции или неспецифических взаимодействий. Другие важные соображения, которые должны быть оптимизированы перед завершением работы над панелями IBEX, включают зонтичный эффект, когда экранирование эпитопов может произойти, если порядок не соответствует конкретному задаваемому исследовательскому вопросу. Чтобы избежать просвечивания флуоресцентного антигена, обычно мишени с более высокой экспрессией антигена помещаются в дальние красные каналы, которые имеют наименьшее просачивание и более слабые маркеры в диапазоне 480-520 нм, которые будут иметь наилучшее соотношение сигнал/шум, учитывая, что эти флуоресцентные красители являются самыми яркими⁷. Тем не менее, следует проявлять осторожность при выборе образцов тканей с высокой аутофуоресцентностью, которые могут быть наиболее яркими в этом диапазоне; Мы рекомендуем решить эту проблему путем визуализации ткани без каких-либо красителей для устранения потенциальных уровней аутофлуоресценции. В совокупности эти шаги по оптимизации, предпринятые при обычной оптимизации и контроле, обычно выполняемом с помощью IBEX, могут помочь в правильном проектировании панели для IBEX с реагентами TSA.

В этом методе мы продемонстрировали использование двух распространенных автопятен. Тем не менее, эти подходы могут быть применены и к другим методам автоокрашивания. Ключевым моментом здесь является оптимальное удаление покровных покрытий и влажной нагрузки для дополнительных окрашивающих кругов. Кроме того, мы не указываем какую-либо конкретную настройку микроскопа. Несмотря на то, что наборы могут рекомендовать использование с определенными системами визуализации для оптимального сканирования предметных стекол, любая конфигурация микроскопа, особенно эпифлуоресцентный микроскоп с совместимыми фильтрующими кубами и светодиодным источником света широкого спектра, должна подойти. Для некоторых красителей требуются мультиспектральные детекторы или специализированные фильтрующие кубы, которые могут быть доступны не во всех лабораториях и могут представлять проблемы при использовании со стандартными фильтрующими кубами из-за их спектрального перекрытия. Эти красители лучше разделяются с помощью мультиспектральных систем визуализации или высокоспецифичных фильтров. Некоторые флуорофоры выходят за пределы диапазона обычных дальних красных фильтров (обычно ~700 нм) и требуют специализированного фильтрующего куба или детектора, способного улавливать сигналы ближнего инфракрасного диапазона. Специализированные микроскопы строятся с этими фильтрами, но существуют и альтернативы. Они потребуют дополнительной оптимизации, чтобы определить, как красители ведут себя в данной конфигурации микроскопа.

Мультиспектральное расмешивание настоятельно рекомендуется для мультиплексных флуоресцентных ИГХ, особенно при работе с тканями, склонными к автофлуоресценции, поскольку оно эффективно отделяет истинный сигнал от фонового шума. Автофлуоресценция, которая часто перекрывается со спектрами излучения широко используемых флуорофоров (особенно в каналах с более высокой длиной волны), может затемнять или создавать помехи для определенных сигналов, снижая точность. Спектральное расмешивание математически распутывает перекрывающиеся спектры излучения, изолируя реальные флуоресцентные сигналы и «очищая» нежелательную автофлуоресценцию. Спектральное несмешивание особенно ценно в рабочих процессах IBEX, где достижение максимально чистых сигналов имеет решающее значение из-за итеративного характера процесса окрашивания и визуализации. В IBEX сигналы от нескольких раундов окрашивания визуализируются, отбеливаются и накладываются друг на друга для создания составного изображения. Любая автофлуоресценция или просвечивание, которые остаются неразрешенными в одном раунде, могут распространяться по сложенным изображениям, усложняя последующий анализ и снижая уверенность в локализации маркеров. Функция спектрального несмешивания эффективно изолирует истинные флуоресцентные сигналы от фоновой автофлуоресценции, обеспечивая более чистое и точное обнаружение сигнала в каждом отдельном раунде. Такая четкость сигнала необходима для создания надежных составных изображений, в которых несколько маркеров анализируются вместе в течение раундов, что позволяет уверенно фенотипировать и проводить пространственный анализ. Платформа визуализации, используемая для этого протокола, имеет встроенные возможности немикширования, но для совместимости с другими флуоресцентными платформами визуализации всего слайда требуются дополнительные возможности немикширования.

Кроме того, ограничением данной работы является запатентованная природа автокрасителей, поскольку связанные с ними реагенты и буферы для промывки оптимизированы для этих систем, но конкретные составы остаются нераскрытыми. Кроме того, мы сосредоточились исключительно на одном коммерчески доступном программном обеспечении для анализа изображений всего слайда и признаем, что стоимость лицензий на программное обеспечение может представлять собой финансовый барьер для некоторых лабораторий. Дополнительное программное обеспечение^для анализа ^8,9 и опции в R представляются многообещающими; в частности, Bodenmiller Group¹⁰, которая создала набор пакетов, который кажется оптимальным для ядер, поскольку IMCDataAnalysis¹¹ предназначен для воспроизводимого рабочего процесса по анализу мультиплексированных изображений в R. Тем не менее, необходимы дальнейшие усилия по разработке и определению характеристик доступных и экономически эффективных альтернатив для анализа всего слайда IBEX, чтобы обеспечить более широкое внедрение в условиях ограниченных ресурсов. Кроме того, этот подход с использованием автоокрашивателей для IBEX может быть адаптирован для более традиционного окрашивания IBEX, в том числе флуоресцентными конъюгированными первичными антителами, или стандартными вторичными антителами без красителей на основе TSA, если ткань имеет достаточно высокое качество и оптимальное время фиксации для обеспечения хорошего сигнала.

В целом, мы надеемся, что эта работа поможет в применении мультиплексной флуоресцентной ИГХ на основе TSA с использованием регулярно используемого оборудования для патологии для более широкой адаптации IBEX в этих условиях. Этот тип применения действительно подчеркивает универсальность протокола IBEX и демонстрирует его полезность даже при сложных образцах тканей или при больших партиях.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагент для окрашивания комплекты Alexa TSA	ThermoFisher		Альтернативные красители TSA, если микроскопические фильтры Opal недоступны. К ним относятся Alexa Fluor 488 (синий/зелёный канал), Alexa Fluor 555 или 568 (красный канал), Alexa Fluor 647 (дальний красный канал), Alexa Fluor 750 (ближний инфракрасный, если оснащён соответствующими фильтрами).
Антитела Arg1	Клеточная сигнализация	93668	Используется на рисунке 4 в 1:100
Лезвия материала	Leica Biosystems		Или похожее, высокий или низкий профиль зависит от типа ткани
Антитела CD11b	Abcam	AB133357	Использовано на рисунке 4 в 1:2000
Антитела CD163	Abcam	AB182422	Используется на рисунке 4 в 1:500
Антитела CD31	Клеточная сигнализация	77699S	Использовано на рисунке 2 в 1:100
Антитела CD3e	Дако	A045201-2	Используется на рисунке 1 в 1:100
Tool банка Коплина	Fischer Scientific	01-816-21	Или что-то подобное
Материал Cover slips	VWR	v48393-026	Или что-то подобное
Антитела CX3CR1	Abcam	AB308613	Использовано на рисунке 4 в 1:450
Stain DAPI	Акоя	FP1490
Программное обеспечение FIJI			Используется для измерения интенсивности сигнала
Слайды Fisher Superfront	Fisher Scientific	22-037-246	Или что-то подобное
Программное обеспечение HALO	Indica Labs		Пример коммерчески доступного программного обеспечения для анализа изображений. Используется для выравнивания и анализа изображений.
Антитела Iba1	Клеточная сигнализация	17191	Используется на рисунке 4 в 1:800
Программное обеспечение inForm	Акоя		Используется для измерения интенсивности сигнала
Антитела iNOS	Abcam	ab283655	Используется на рисунке 4 в 1:400
Instrument Leica Bond Rx (или RXm)	Leica Biosystems	21.2201	В тексте он называется «Autostainer 1». Убедитесь, что все соответствующие реагенты также доступны, включая коробки для морилки и массовые растворы.
Reagent LiBH4	Сигма-Олдрич	62460-5G-F	Держите в безводной среде
Инструмент Mantra Snap	Акоя		Для удаления красителей необходим мультиспектральный флуоресцентный микроскоп. Пример микроскопа, который можно использовать для обнаружения опаловых красителей.
Tool Microtome	Leica Biosystems		Или аналогично с предпочтительным аксессуарами, такими как кисти
Реагент для окрашивания Opal IHC 480 Kit	Акоя	FP1500001KT	Использовано на рисунке 4
Реагент для окрашивания Opal IHC 6-Plex Plex Kit	Акоя	NEL821001KT	520 и 620 не отбеливают, используются на рисунках 1, 2 и 4
Реагент для окрашивания Opal IHC 780 Kit	Акоя	FP1501001KT	Использовано на рисунке 4
Духовка Tool	Миллипор Сигма	Z683329	Или похожие варианты можно сделать и на автостейнере
Антитела Панцитокератин	Abcam	ab9377	Используется на рисунке 4 в 1:50
Reagent PBS (по желанию)	Fisher Scientific	AAJ61196AP
Инструмент PhenoImager	Акоя		Мультиспектральное изображение целого слайда с встроенным спектральным разведением в программное обеспечение
Reagent ProLong Gold Antifade	Fisher Scientific	P36961	Или аналогичные водные крепящие материалы
Антитела ProSP-C n-терминал (ProSPC)	Биореагенты Seven Hills	WRAB-9337	Используется на рисунке 4 в 1:250
Антитела ЯРОСТЬ	R& D	MAB1179	Используется на рисунках 1 и 2 на 1:50
Реагент реакционный буфер	Рош	NC1895692	Для использования с автостейнером Ventana
Антитела SARS-CoV-2-N	Клеточная сигнализация	68344	Используется на рисунке 2 в 1:1000
Стекло<бр/> TOMO с адгезией CC-микроскопа-WH	Avantik	SKUSL6519-1	Если склеивание тканей вызывает беспокойство
Instrument Ventana Discovery Ultra	Рош		В тексте называется «Autostainer 2». Убедитесь, что все соответствующие реагенты также доступны, включая коробки для морилки и массовые растворы.
Реагент Буфер для промывки	Leica Biosystems	AR9590	Для использования с автостейнером Leica Bond
Реагент<бр/> Вода	Fisher Scientific	15-230-147	DI лучше всего, а не миллипоры
Водяная ванна Tool	Leica Biosystems	140607020C1	Или что-то подобное