Методическая статья

Оценка гипералгезии коленного сустава у мышей с помощью измерения приложения давления

DOI:

10.3791/68480

⸱

13 июня 2025 г.

 ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Rheumatology, Rush University Medical Center, 2Chicago Center on Musculoskeletal Pain

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В протоколе описано, как измерить гипералгезию коленного сустава у мышей. Мы показываем примеры на мышиных моделях острой боли в колене, а также на моделях остеоартрита (ОА).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка гипералгезии коленного сустава обеспечивает надежный анализ для измерения периферической сенсибилизации в коленном суставе и представляет клинически значимое болево-зависимое поведение, которое может быть использовано в моделях артрита у грызунов. Сообщалось о нескольких методах определения порога реакции на компрессию колена у грызунов. Здесь мы стремились адаптировать существующие методы для разработки стандартизированного метода оценки гипералгезии коленного сустава у взрослых мышей с использованием устройства для измерения давления (PAM). Протокол включает в себя подробные шаги, рекомендации по обучению для новых экспериментаторов и советы по достижению стабильных результатов. Мы даем рекомендации по оптимальной подготовке нового экспериментатора. Наконец, представлены репрезентативные исходы как для моделей острой транзиторной гипералгезии, так и для экспериментальных моделей остеоартрита (ОА), которые характеризуются хронической болью. Этот метод обладает высокой чувствительностью к фармакологическим вмешательствам, что делает его пригодным для оценки эффектов медиаторов, таких как цитокины, и для скрининговых анализов лекарственных препаратов со средней пропускной способностью. Таким образом, описанный подход обеспечивает надежный и клинически значимый метод количественной оценки гипералгезии коленного сустава.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Остеоартрит (ОА), наиболее распространенная форма артрита, характеризуется прогрессирующей деградацией хряща, синовитом, ремоделированием костии ростом остеофитов1 и клинически проявляется болью и потерей функции суставов. ОА является одним из основных источников хронической боли в мире, глубоко влияя на жизнь пациентов из-за ограниченной подвижности и связанных с этим проблем со здоровьем, таких как тревога и депрессия 2,3. Обычно назначаемые препараты для лечения боли при остеоартрите включают нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), вискозные добавки, кортикостероиды и опиоиды, но их эффективность ограничена, а их длительное применение связано с серьезными побочными эффектами или риском привыкания 1,4.

В последние годы в крупных когортных исследованиях была предпринята попытка тщательно описать боль, испытываемую во время прогрессирующего ОА5. В рамках этой работы в нескольких исследованиях было проведено количественное сенсорное тестирование (QST) у пациентов с ОА с общей целью выявления сенсибилизации и определения связи между показателями QST и симптомами и тяжестью ОА, а также ответом на лечение (рассмотрено впункте 6). Международная ассоциация по изучению боли определяет сенсибилизацию как повышенную реакцию ноцицептивных нейронов на их нормальный вход и/или рекрутирование ответа на обычноподпороговые входы. Становится все более очевидным, что сенсибилизация является ключевым процессом, лежащим в основе хронической боли при ОА. Одним из конкретных результатов QST, который надежно отличает пациентов с симптоматическим ОА от контрольной группы, является снижение порога болевого давления (PPT). Мета-анализ значений ППТ (как в колене, так и в местах, удаленных от колена) 1003 участников с ОА коленного сустава и без него показал значимую стандартную среднюю разницу (СРС, разница в средних значениях, деленная на стандартное отклонение) в ППТ между лицами с ОАи контрольной группой.

Наблюдение за тем, что пациенты с ОА проявляют сенсибилизацию к механическим раздражителям, которая проявляется в снижении порогов болевого давления при приложении силы к суставу, предполагает основные механизмы периферической и центральной сенсибилизации, которые являются результатом изменений в болевом пути6. Молекулярные и клеточные основы этих изменений могут быть изучены на моделях ОА у грызунов. В последние годы были разработаны сложные мышиные модели для моделирования медленно прогрессирующего характера ОА коленного сустава, и этот подход показал, что различные механизмы боли действуют в зависимости от времени, что может иметь важное трансляционноезначение. Например, в ходе хирургически индуцированного экспериментального ОА коленного сустава у мышей развивается механическая аллодиния в оперированной задней лапе на ранних стадиях заболевания, в то время как дефицит нагрузки становится очевидным только на позднейстадии заболевания.

Как и у пациентов с ОА, у мышей с экспериментальным ОА развивается пониженный болевой порог для боли в колене на ранних стадиях экспериментального ОА коленного сустава10. Это свидетельствует о сенсибилизации иннервирующих колено ноцицепторов, что действительно может быть визуализировано и количественно оценено с помощью визуализации кальция in vivo в ганглиях поясничного дорсального корешка11. Оценка гипералгезии коленного сустава обеспечивает надежный и относительно простой анализ для измерения периферической сенсибилизации, таким образом, представляя клинически значимое болевозависимое поведение, которое может быть использовано в моделях артрита у грызунов. Сообщалось о нескольких методах определения порога реакции на компрессию колена у грызунов. В более старых исследованиях сообщалось о сдавливании колена между большим и указательным пальцами и регистрации субъективной реакции отмены или реакции вокализации у животного 12,13,14 В 2007 году Barton et al. сообщили об измерении приложения давления (PAM) в качестве нового поведенческого метода для регистрации механической гиперчувствительности колена крысы при воспалительном артрите 15. Впоследствии метод был валидирован на мышах с антиген-индуцированным артритом коленного сустава 16. PAM — это метод, при котором преобразователь силы прикладывает увеличивающуюся силу к пораженному колену, обеспечивая при этом визуальную обратную связь, тем самым обеспечивая воспроизводимую компрессию колена, что повышает его чувствительность и воспроизводимость. Эти два ранее опубликованных исследования были сосредоточены на моделях воспалительного артрита, где отек колена является заметным. Таким образом, мы стремились адаптировать эти методы15,16 для разработки стандартизированного метода оценки гипералгезии коленного сустава у мышей, который может быть легко применен к моделям ОА и обладает высокой чувствительностью к фармакологическому вмешательству, как описано здесь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в учреждении Университета Раш. Описанный протокол предназначен для оценки гипералгезии коленного сустава в правом колене в ответ на механический раздражитель у взрослых мышей C57BL/6 (в возрасте от 10 недель до 2 лет) любого пола. Чтобы измерить гипералгезию коленного сустава в левом колене, поменяйте руки.

1. Настройка устройства для измерения приложения давления (PAM)

  1. Подключите один кабель от устройства PAM к компьютеру, а второй кабель от устройства PAM к преобразователю силы.
  2. Включите компьютер и запустите программу PAM. Установите максимальное давление на 450 g.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение и малый преобразователь могут измерять до 500 g. Таким образом, экспериментатор может выбрать плато в диапазоне от 450 г до 500 г, но максимальный предел не должен меняться в течение эксперимента.
  3. Оставьте мышей в комнате для тестирования на 15-30 минут, пока они не акклиматизируются и не приживутся. Убедитесь, что помещение для тестирования является отдельным помещением от места, где содержатся мыши, и что в помещении тихо. Используйте одну и ту же комнату для тестирования на протяжении всего исследования.
  4. Проведите предварительную акклиматизацию, если это необходимо, чтобы успокоить мышей перед началом исследования - в этом случае сдерживайте животных, держа мышь в левой руке, удерживая спину и крепко удерживая хвост4-м и5-м пальцами (как это было бы при проведении теста), за 2 дня до первого дня тестирования с целью акклиматизации мышей к анализу. В рамках данного эксперимента акклиматизируйте всех мышей одинаковым образом.
  5. После акклиматизации убедитесь, что мышь спокойна и не извивается при сдерживании. Если мышь не спокойна, верните ее в клетку и отложите тестирование на несколько дней.

2. Тренинг по измерению гипералгезии коленного сустава

  1. Начните с наивных животных и научитесь распознавать реакции, когда животные спокойны. Это позволит экспериментатору распознать, какова нормальная реакция на данный анализ.
  2. Используйте экспериментальную модель, в которой гипералгезия колена была охарактеризована опытным испытателем, чтобы знать, чего ожидать. Следует признать, что при экспериментальном остеоартрите реакции могут быть менее очевидными, чем при моделях острого или воспалительного синдрома.
  3. Используйте лидокаин или опиат для того, чтобы обратить вспять болевое поведение - это поможет оценить, как отличить реакцию на стресс от реальной реакции, связанной с болью.
  4. Выполняйте все тестирование таким образом, чтобы не учитывать распределение по группам. Проведите эксперимент с моделью ОА с известными анальгетиками в эксперименте, управляемом транспортным средством. Убедитесь, что тестер может различить эти группы и получить воспроизводимые измерения.
  5. Будьте готовы к тому, что прохождение обучения может занять несколько недель.

3. Базовое измерение гипералгезии коленного сустава с помощью PAM

Примечание: Многие экспериментальные модели воспалительного артрита или остеоартрита являются односторонними (например, хирургически индуцированный ОА коленного сустава). Чтобы оценить гипералгезию коленного сустава в этих моделях, мы всегда сначала измеряем порог отхождения коленного сустава в контралатеральном колене всех тестируемых мышей. После этого мы тестируем ипсилатеральное колено. Например, этот протокол может быть применен для измерения гипералгезии коленного сустава при экспериментальном ОА, индуцированном ДММ. В этой модели повреждение сустава сопровождается гипералгезией коленного сустава, развивающейся ко 2-й неделе после операции и сохраняющейся до16-17 недели.

  1. Держите мышку в левой руке, удерживая спину и крепко удерживая хвост вниз4-м и5-м пальцами.
  2. Проденьте указательный палец другой руки (правой руки) через завязку датчика (рисунок 1A). Затем поместите указательный палец с датчиком в прозрачный пластиковый пакет (например, пакет для бутербродов). Это предотвратит загрязнение датчика, например, мочой мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Датчик хрупкий и легко ломается, если он не защищен от жидкостей или при приложении слишком высокой силы.
  3. Большим и средним пальцами правой руки возьмитесь за правую ногу и средним пальцем аккуратно прижмите лапу к тенару левой руки (Рисунок 1B). Правильное положение колена в начале тестирования составляет около 90° сгибания.
  4. Когда колено сгибается на 90°, большой палец правой руки касается боковой стороны колена. Касаясь указательным пальцем медиальной стороны датчика, медленно надавите на колено. В соответствии с указаниями компьютерного программного обеспечения (синяя линия на графике) прикладывайте возрастающую силу с постоянной скоростью (30 г/с), до 450 г или до тех пор, пока мышь не проявит поведение, связанное с болью, такое как вокализация, подергивание мышц, извивание тела или движение усов.
  5. Как только мышь проявит поведение, связанное с болью, отведите палец с датчиком от колена и запишите давление, отображаемое на экране (рис. 1C). Если мышь не проявляет поведения, связанного с болью, при достижении 450 g, все равно отпустите датчик и назначьте значение 450 g в качестве порога вывода для этого теста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая отдельная мышь выражает болевую реакцию по-своему. Таким образом, тестировщик должен определить, какое поведение, связанное с болью, проявляют отдельные мыши. Тем не менее, некоторые мыши вообще не проявляют поведения, связанного с болью, и в этом случае тестер может либо повторно протестировать контралатеральное колено, чтобы определить индивидуальную реакцию мыши на боль через пару дней, либо продолжить измерение ипсилатеральной стороны и определить модель поведения. Последний вариант требует многочасового опыта, поэтому новичку рекомендуется использовать первый вариант.
  6. Верните мышь в клетку и приступайте к тестированию следующей мыши. Когда одно колено будет проверено на всех мышах, вернитесь к первой мыши и повторите тестирование. Проверьте каждое колено по 2 раза и возьмите среднее значение двух результатов теста в качестве окончательного результата. Это число называется порогом вывода средств.
    1. Если разница между1-м и2-м измерениями составляет ≥ 60 г, сделайте3-е измерение и используйте среднее значение трех измерений в качестве конечного результата. Старайтесь не подвергать мышей стрессу и избегайте многократных последовательных измерений на одной и той же мыши. Вот почему между каждым последующим измерением должно быть некоторое время.
  7. Проверьте гипералгезию коленного сустава в слепых условиях, чтобы избежать смещения. Используйте индивидуальные ушные бирки для облегчения ослепления. Определение того, является ли поведение мыши признаком боли, требует практики, опыта и уверенности, потому что тестировщик должен использовать свое суждение. Вот почему так важно не обращать внимания на экспериментальные группы.

4. Измерение гипералгезии коленного сустава на модели острой боли в колене

  1. После исходного измерения гипералгезии колена сбрейте шерсть вокруг колена.
  2. Обезболите животное изофлураном и проверьте правильность анестезии с помощью рефлекса щипкового пальца ноги. Используйте ветеринарную мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость во время пребывания под анестезией. Введите 5 мкл Pam3CSK4 (1 г или 3 мкг растворенного в стерильной воде) или контрольного средства (5 мкл) через сухожилие надколенника во внутрисуставное пространство правого или левого колена с помощью шприца Hamilton с иглой 30G.
  3. Оценивайте гипералгезию коленного сустава через 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч и 24 ч после инъекции в условиях слепоты.
  4. Для оценки эффекта лидокаина введите либо лидокаин (20 мг/кг в физрастворе), либо физиологический раствор внутрисуставно через 4 ч после инъекции Pam3CSK4. Затем оцените гипералгезию коленного сустава через 0,5 ч, 2 ч и 20 ч.

5. Продольная оценка гипералгезии коленного сустава в затяжной модели ОА

  1. Оцените исходный уровень гипералгезии коленного сустава у самцов 12-недельных мышей C57BL/6.
  2. Выполните дестабилизацию медиального мениска (ДММ) или фиктивную операцию на одном колене, как описано впункте 18.
  3. Оцените гипералгезию коленного сустава через 2, 4, 8, 12 недель и 16 недель после операции.
  4. Для оценки эффекта внутрисуставного лидокаина оценивайте гипералгезию коленного сустава через 4 недели после ДММ, а затем вводите лидокаин (20 мг/кг в 5 мкл) или физиологический раствор под анестезией изофлурана, как описано на этапе 4.
  5. Оцените гипералгезию коленного сустава через 20 мин, 120 мин и 240 мин после инъекции лидокаина.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Временной ход гипералгезии коленного сустава на модели острой боли в колене
Все показанные результаты были ранее сообщены нашей группой, и мы ссылаемся на10для подробного описания. В первом примере показана модель индуцирования острой, транзиторной гипералгезии коленного сустава. В этом эксперименте мы вводили Pam3CSK4, синтетический лиганд толл-подобного рецептора 2 (TLR2) (1 г или 3 мкг, растворенный в стерильной воде) в дозе 5 мкл, в коленну...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Измерение гипералгезии коленного сустава у мышей предлагает относительно быстрый и простой способ оценки гипералгезии коленного сустава, связанной с экспериментальным артритом. Как видно из представленных репрезентативных результатов, анализ может выявить острое начало и транзиторную гипералгезию (рисунок 2A). Мы сообщали о таком поведении в ответ на несколько медиаторов, вводимых в коленный сустав, включая фрагмент агрекана10, нейрот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AMM является консультантом для Novartis, Merck, Roivant и Averitas. Она получила исследовательскую поддержку от Orion и Eli Lilly. SI и REM нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наши исследования финансируются Национальным институтом артрита, костно-мышечных и кожных заболеваний, номера грантов/наград: P30AR079206 (AMM), R01AR060364 (AMM), R01AR064251 (AMM), UC2AR082186 (AMM), R21AR085242-01 (AMM) и R01AR077019 (REM).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антагонист C-C хемокина 2 рецептора (CCR2RA)ТокрисRS 504393
Компьютер (любой тип)Минимум Windows 7
ЛидокаинаСигмаL5647
Измерение применения давления (P.A.M)Уго Базиле38500включал преобразователь, компьютер, кабели
Сэндвич-пакетWhole Food Market6-1/2 x 5-7/8Закройте преобразователь
тол-подобный рецептор 2 лиганд Pam3CSK4invitrogentlrl-pms

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tang, S., et al. Osteoarthritis. Nat Rev Dis Primers. 11 (1), 10(2025).
  2. Allen, K. D., Thoma, L. M., Golightly, Y. M. Epidemiology of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 30 (2), 184-195 (2022).
  3. Schmukler, J., et al. 36-40% of Routine Care Patients With Osteoarthritis or Rheumatoid Arthritis Screen Positive for Anxiety, Depression, and/or Fibromyalgia on a Single MDHAQ. ACR Open Rheumatol. 6 (10), 641-647 (2024).
  4. Smith, S. R., Deshpande, B. R., Collins, J. E., Katz, J. N., Losina, E. Comparative pain reduction of oral non-steroidal anti-inflammatory drugs and opioids for knee osteoarthritis: systematic analytic review. Osteoarthritis Cartilage. 24 (6), 962-972 (2016).
  5. Neogi, T. The epidemiology and impact of pain in osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 21 (9), 1145-1153 (2013).
  6. Arant, K. R., Katz, J. N., Neogi, T. Quantitative sensory testing: identifying pain characteristics in patients with osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 30 (1), 17-31 (2022).
  7. Loeser, J. D., Treede, R. D. The Kyoto protocol of IASP Basic Pain Terminology. Pain. 137 (3), 473-477 (2008).
  8. Fingleton, C., et al. Pain sensitization in people with knee osteoarthritis: a systematic review and meta-analysis. Osteoarthritis Cartilage. 23 (7), 1043-1056 (2015).
  9. Miller, R. E., Malfait, A. M. Osteoarthritis pain: What are we learning from animal models. Best Pract Res Clin Rheumatol. 31 (5), 676-687 (2017).
  10. Miller, R. E., et al. An aggrecan fragment drives osteoarthritis pain through Toll-like receptor 2. JCI Insight. 3 (6), e95704(2018).
  11. Miller, R. E., et al. Visualization of Peripheral Neuron Sensitization in a Surgical Mouse Model of Osteoarthritis by In Vivo Calcium Imaging. Arthritis Rheumatol. 70 (1), 88-97 (2018).
  12. Gauldie, S. D., et al. A robust model of adjuvant-induced chronic unilateral arthritis in two mouse strains. J Neurosci Methods. 139 (2), 281-291 (2004).
  13. Knights, C. B., Gentry, C., Bevan, S. Partial medial meniscectomy produces osteoarthritis pain-related behaviour in female C57BL/6 mice. Pain. 153 (2), 281-292 (2012).
  14. Yu, Y. C., et al. Two variables that can be used as pain indices in experimental animal models of arthritis. J Neurosci Methods. 115 (1), 107-113 (2002).
  15. Barton, N. J., et al. Pressure application measurement (PAM): a novel behavioural technique for measuring hypersensitivity in a rat model of joint pain. J Neurosci Methods. 163 (1), 67-75 (2007).
  16. Leuchtweis, J., et al. Validation of the digital pressure application measurement (PAM) device for detection of primary mechanical hyperalgesia in rat and mouse antigen-induced knee joint arthritis. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 32 (8), 575-583 (2010).
  17. Miller, R. E., et al. Chemogenetic Inhibition of Pain Neurons in a Mouse Model of Osteoarthritis. Arthritis Rheumatol. 69 (7), 1429-1439 (2017).
  18. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  19. Obeidat, A. M., et al. Piezo2 expressing nociceptors mediate mechanical sensitization in experimental osteoarthritis. Nat Commun. 14 (1), 2479(2023).
  20. Wang, L., et al. Notch signaling is activated in knee-innervating dorsal root ganglia in experimental models of osteoarthritis joint pain. Arthritis Res Ther. 25 (1), 63(2023).
  21. Obeidat, A. M., et al. Intra-articular sprouting of nociceptors accompanies progressive osteoarthritis: comparative evidence in four murine models. Front Neuroanat. 18, 1429124(2024).
  22. Geraghty, T., et al. Acute systemic macrophage depletion in osteoarthritic mice alleviates pain-related behaviors and does not affect joint damage. Arthritis Res Ther. 26 (1), 224(2024).
  23. Bergman, R. F., et al. Sexual dimorphism of the synovial transcriptome underpins greater PTOA disease severity in male mice following joint injury. Osteoarthritis Cartilage. 32 (9), 1060-1073 (2024).
  24. Geraghty, T., et al. Age-Associated Changes in Knee Osteoarthritis, Pain-Related Behaviors, and Dorsal Root Ganglia Immunophenotyping of Male and Female Mice. Arthritis Rheumatol. 75 (10), 1770-1780 (2023).
  25. Ishihara, S., et al. The role of intra-articular neuronal CCR2 receptors in knee joint pain associated with experimental osteoarthritis in mice. Arthritis Res Ther. 23 (1), 103(2021).
  26. Liu, H., et al. Sirt5 regulates chondrocyte metabolism and osteoarthritis development through protein lysine malonylation. bioRxiv. , (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Osteoarthritis PainMouse Pain AssayPeripheral SensitizationPain ThresholdIntraarticular InjectionDMM SurgeryPain BehaviorDrug Screening

Похожие статьи