Method Article

Отслеживание отдельных белков в липидных бислоях с помощью флуоресцентной микроскопии

DOI:

10.3791/69095

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Washington State University, 2Department of Biosciences, Biotechnology and Environment, University of Bari Aldo Moro

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье подробно описано, как создавать образцы для отслеживания одного белка в твердо поддерживаемых липидных бислоях. Это также объясняет простой флуоресцентный микроскоп с чувствительностью к одной молекуле и высокой частотой кадров. Наконец, мы описываем процедуру извлечения траекторий с одним белком.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прямое наблюдение является фундаментальным методом научных открытий и понимания. Одномолекулярная флуоресцентная визуализация с таймлапсом позволяет наблюдать отдельные белки по мере их движения и взаимодействия с окружающей средой, делая видимыми состояния, которые обычно были бы скрыты в ансамблевых измерениях. Отслеживание по одному белку особенно подходит для изучения мембранных белков, где его двумерная природа позволяет быстро и широкоугольно визуализировать с чувствительностью к одному флуорофору. Использование искусственных липидных бислоев, имитирующих мембраны, где находятся трансмембранные или периферические мембранные белки (например, плазматические мембраны или мембраны внутриклеточных органелл различных типов клеток), позволяет измерять специфические взаимодействия в близко-родных средах. Это также позволяет постепенно добавлять сложность, по одному компоненту за раз, при этом подавляя фоновые помехи от флуоресценции и рамановского рассеяния. Добавив контроль температуры, становится возможным определить термодинамические свойства взаимодействий отдельных частиц. В этой работе мы описываем протокол подготовки образцов, сбора данных, отслеживания флуоресценции по одной молекуле и анализа траекторий мембранных белков в липидных бислоях с использованием Aquaporin-4. Эта работа служит основополагающим примером и может быть адаптирована к различным белкам и двуслойным составам.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В естественных биологических условиях мембранные белки окружены обширной сетью взаимодействий, включающей другие мембранные белки, белки внутриклеточных и внеклеточных жидкостей, различные типы липидов и холестерина, субстраты или лиганды, взаимодействия раствора, а также взаимодействия между внеклеточными и внутриклеточными матрицами. Классический биофизический подход для лучшего понимания конкретных и коллективных взаимодействий начинается с одного компонента, постепенно вводя дополнительные компоненты по одному, пока сложность не отражает родную среду — подход «разделяй и властвуй» в биофизике. Современный молекулярный метод изучения этих взаимодействий — это прямое наблюдение с использованием одномолекулярной флуоресцентной визуализации с таймлапсом для отслеживания движения и взаимодействия отдельных белков с окружающей средой. В этой статье мы описываем фундаментальные этапы этого подхода, включая формирование липидных билейров на кварцевых покрытиях и вставку крупного мембранного белка в эти готовые бислои способом, подходящим для однобелковой визуализации. За этим следует протокол «рабочей лошадки» для отслеживания отдельных белков в поддерживаемых бислоях.

В этой статье описывается, как создавать твердоподдерживаемые липидные бислои с помощью небольших униламеллярных везикул (SUV), которые разрываются на гидрофильных кварцевых покровных сдвигах. Кварцевые поверхности готовятся либо кислотной промывкой, либо ультрафиолетовой (УФ) озоновой очисткой. Липид, используемый для создания внедорожников, по возможности должен соответствовать основному химическому составу интересующей биологической мембраны (например, аквапорин-4 (AQP4) содержится в плазматической мембране астроцитов, а основными компонентами являются POPC (46,4%), POPE (8,5%), PS (5,6%), холестерин (30%), PI (2,5%) и SM (5,6%))1,2). Чтобы предотвратить взаимодействие с твёрдым субстратом, такие добавки, как полиэтиленгликоль (ПЭГ), пришивённые к липиде, поднимают бислой споверхности 3,4. Количество каждой добавки необходимо тщательно регулировать, чтобы диффузия белка не была затруднена, а также обеспечить достаточную поддержку для подъёма мембраны с поверхности субстрата. Добавки, такие как ПЕГилированные липиды, обычно имеют две фазы: «кисточную фазу» и «грибную фазу». Фаза щётки наступает, когда ПЭГ находится в высокой концентрации, что заставляет полимер стоять вертикально для уменьшения стерических препятствий. Грибная фаза наступает при низких концентрациях, когда полимеры достаточно отделены, чтобы существовать в виде случайных катушек. В целом, фаза кисти снижает диффузию, но грибная фаза оказывает мало поддержки. Концентрация между фазами кисти и гриба оптимальна, обеспечивая поддержку с минимальным влиянием надиффузию 3,4.

Некоторые мембранные белки спонтанно внедряются в липидные мембраны с твёрдой поддержкой, такие как P450 и цитохром P450редуктаза 5, в то время как другие необходимо вводить с помощью моющих средств, что является деликатным процессом. Для удаления этих моющих средств, а также любых невключенных белков, которые могут мешать отслеживанию одного белка — процесс, который будет подробно описан. Основное внимание этой статьи уделяется подготовке образца для отслеживания отдельных молекул (SMT) с использованием таймлапс-флуоресцентной визуализации. Для этого требуется объектив с большим увеличением и числовой апертурой (NA) — обычно 100x и 1,45 NA с масляным погружением 6,7. Также требуется быстрая, высокочувствительная камера (EMCCD, CMOS или ICCD) и лазерное возбуждение. Лазерное возбуждение должно охватывать достаточно большое поле зрения для измерения длинных траекторий белков, что часто достигается с помощью полного внутреннего отражения для создания эванесцентного поля примерно 50 мкм x 100 мкм или эпи-освещения с оптикой формования луча (от гаусса до топ-хэта) примерно 80 мкм x 80 мкм8 или сильно наклонённого и ламинированного оптического листа (HILO) с полем, похожим на TIRF. Микроскопия полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) имеет преимущество в снижении фоновых сигналов. Ниже представлен простой и относительно недорогой дизайн микроскопа TIRF. Добавляя температурные регуляторы, можно измерить несколько термодинамических свойств, таких как энтальпия, энтропия и свободная энергияГиббса 9. Метод также требует флуоресцентной маркировки мембранного белка с такой степенью, что гарантирует, что большинство мембранных белков имеют флуоресцентную метку.

Трансмембранный белок, представляющий интерес в этой статье, — AQP4. AQP4 — это водный канал, поляризованный в крайних стопах астроцитов и других областяхсосудистого органа 10 центральной нервной системы. Он способен транспортировать до 3 миллиардов молекул воды в секунду и участвует в гомеостазе воды, миграции клеток, отёке мозга, обучении и формировании памяти через синаптическуюпластичность 11. Дисрегуляция функции AQP4 связана с различными неврологическими заболеваниями, включая отёк мозга, оптический нейромиелит иэпилепсию 12,13,14,15. AQP4 — это белок с концентрацией 32–37 кД, в зависимости от изоформы, имеющий тетрамерную четвертичную структуру с восемью гидрофобными мембранными доменами, соединёнными соединяющими петлями, внутриклеточным N-терминальным доменом и крупным внутриклеточным C-терминальнымдоменом 16. Существует две основные изоформы AQP4 — M1 и M23; Разница возникает из-за инициации в остатке метионина 1 или остатка метионина 23. Исследования показали, что изоформа M1 может образовывать диады или триады с собой в зависимости от степени пальмитоилирования9. Изоформа M23 собирается в крупные белковые агрегаты, известные как ортогональные массивы частиц (OAP). При совместной экспрессии изоформа M1 ограничивает рост OAP, образуя периферическую белковую оболочку вокруг своейвнешней части 17,18,19. Динамика агрегации OAP может быть ключевым фактором в модулировании водопроницаемости и гомеостаза в мозге. В этой статье мы описываем необходимые шаги для отслеживания отдельных AQP4 в мембране и наблюдения взаимодействий отдельных белков и белков.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка мелких однообразных пузырьков

  1. Достаньте растворы липидного бульона из морозилки и дайте им достичь комнатной температуры.
  2. Достаньте чистую колбу на 10 мл из духовки и дайте ей остыть до комнатной температуры.
  3. Добавьте 900 мкл спектроскопического хлороформата и 100 мкл спектроскопического метанола в холодную колбу с круглым дном, затем добавьте соответствующие количества каждого липида в смесь. Покрутите фляжку, чтобы липиды были хорошо смешаны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие авторы используют разные соотношения хлороформ и метанол, но мы обнаружили, что лучшее соотношение для формирования однородных липидных опряжек составляло 9:1.
    Таблица для расчёта правильного количества липидов приведена в Дополнительном файле 1. При подготовке липидов для подтверждения образования липидного двуслоя на поверхности субстрата используйте флуоресцентно маркированный липид.
  4. Поставьте вакуумный дистилляционный разъём поверх колбы с круглым дном, как показано на рисунке 1, и подключите его к азотной линии (сушильному аппарату).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте очищенный N2(g) и пропустите его через фильтр 0,22 мкм перед подключением к сушильному аппарату.
  5. ВключитеN 2(g) и отрегулируйте давление так, чтобы поток был почти не ощущался на тыльной стороне руки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смачивание тыльной стороны руки помогает почувствовать испарение.
  6. Дайте образцу высохнуть под течениемN 2(g) в течение 2,5–3 часа, периодически проверяя, продолжается ли поток азота. Образец, скорее всего, будет выглядеть сухим в первые полчаса; однако продолжайте подачу азота ещё 2–2,5 часа, чтобы удалить оставшийся растворитель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец также можно сушить на ночь.
  7. Добавьте 1 мл буфера на каждые 5,0 мкмоль общего количества липидов в колбу с круглым дном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер, использованный в этом исследовании, включал 100 мМ HEPES, 5 мМCaCl2 и 140 мМ NaCl; Это тот же буфер, который используется при приготовлении образца.
  8. Положите стеклянную пробку на колбу и оберните её керофиновой пленкой.
  9. Поместите флягу в зажим на кольцевую подставку и погрузите дно в ванну соникатора, установленного на 60 °C. Дайте фляжке инкубироваться 1 час, аккуратно поворачивая каждые 15 минут, чтобы создать многопластинчатые липосомы, которые выглядят как непрозрачный раствор без липидов, прикреплённых к колбе.
  10. После инкубации в 1 ч включите соникатор (~35 кГц) и установите амплитуду на максимальную уровень. Затем переместите колбу в ванне, чтобы найти место с наибольшим перемешиванием, чтобы раствор ударялся и распылялся внутри. Сониковать 30 минут, в поисках перехода от непрозрачности к прозрачному и слегка опалесцентному.
  11. Удалите липидный раствор из колбы и поместите его в микроцентрифугную трубку, затем центрифугайте при 100 000 × г в течение 1 часа при 4 °C. Удалите супернатант из микроцентрифугальной трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На дне трубки может образоваться небольшая гранула. Если гранула большая, выбросьте её и повторите процесс.
  12. Используйте внедорожники после центрифуга, храните при 4 °C неделю или держите при -80 °C с трегалозой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое количество трегалозы составляет 1 мг на мл липидного раствора. Для достижения оптимального результата новые внедорожники можно производить каждую неделю и хранить их в холодильнике.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это лишь один из способов подготовки внедорожников. Помимо внедорожников, малые, средние и крупные униламеллярные везикулы могут быть получены с помощью экструзии или гигантских униламеллярных липосом, посредствомэлектроформирования 20,21,22,23.

2. Маркировка белков

ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка белков флуоресцентными зондами с использованием различных конъюгатов, таких как эфиры NHS и малеимиды, хорошо задокументирована и хорошо изучена. Однако степень маркировки (DOL) особенно важна при отслеживании одного белка. В этом исследовании было важно определить, какой процент трансмембранных белков был помечен, а также распределение флуорофоров на каждом тетрамере AQP4.

  1. Поместите диализную трубку в стакан с буфером фосфатов 0,1 М при pH 8,3, пропущенный через фильтр 0,22 мкм. Затем оставьте мембрану в буфере на ночь в перевёрнутом положении, чтобы мембрана могла привыкнуть.
  2. На следующий день замените буфер внутри диализа на белковый раствор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объём раствора белка должен быть в пределах 20-250 мкл. В растворе должно быть ~1-5 мг растворённого белка.
  3. После того как белок помещают в диализную трубку, оставьте его инвертированным на ночь в буфере фосфатов 0,1 м.
  4. После диализа перенесите белок в микроцентрифуговую трубку.
  5. Подготовьте новую трубку для диализа, повторяя шаг 2.1.
  6. Подготовьте краситель NHS, положив несколько зерен (3-4) на небольшой кусок бумаги для взвешивания, затем переместите его в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл и растворите в 100 мкл DSMO. Затем проводите два разбавления по 1 мл 10-кратного разведения в DMSO, используя окончательное разбавление для определения концентраций каждого образца с помощью УФ-виз-спектроскопии. Чтобы достичь среднего DOL 2-3, добавьте в раствор белка трёхкратное молярное избыточное количество реактивного красителя при аккуратном встряхивании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой цели достаточно стандартного ультрафиолетового спектрометра, хотя малообъёмный спектрометр выгоден из-за размера выборки.
  7. Добавьте реактивный краситель в микроцентрифугную трубку, содержащую белок, в равных объёмах. После добавления реактивного красителя и белка нутировать минимум 8 часов.
  8. После нутации перенесите маркированный белок в диализную трубку, подготовленную на этапе 2.5, и поместите его в стакан с буфером свежего фосфата. Поместите в буфер размешиватель и дайте ей аккуратно покрутиться 6 часов, затем замените буфер и проведите ещё 6 часов диализа.
  9. После замены двух буферов поместите диализаторную трубку с маркированным белком в чистую стакану с последним рабочим буфером.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный рабочий буфер, использованный в этом исследовании, включал 100 мМ HEPES, 5 мМCaCl 2 и 140 мМ NaCl при pH 7,4.
  10. После диализа измеряйте DOL с помощью ультрафиолетового спектрометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно следовать стандартным методам измерения DOL. Ниже приведено уравнение для расчёта.
    figure-protocol-1(1)
    Где поглощение, измеряемое на пике красителя, равно figure-protocol-2 , а пик белка на 280 нм равен figure-protocol-3. Коэффициент вымирания белка ( figure-protocol-4 рассчитывается на основе молекулярной массы белка), а figure-protocol-5 и figure-protocol-6 предоставляется производителем красителя.

3. Подготовка кварцевых накладок диаметром 25 мм

ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведены два разных метода:

  1. Кислотная промывка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько опубликованных процедур кислотной промывки, включая пиранью и травление оснований. Мы обнаружили, что приведённая ниже процедура обеспечивает чрезвычайно чистую и гидрофильную поверхность без травления, что предпочтительнее для одномолекулярных исследований с использованием флуоресцентной визуализации.
    1. Метод Acid Wash требует вытяжки для выпарения при нагреве раствора и средств индивидуальной защиты (очки, лабораторный халат, перчатки). В капоте должна быть бутылка с бикарбонатом натрия на случай разлива.
    2. Поместите накладки в стакан и наполните наночистой водой, перекисью водорода 30% и концентрированной азотной кислотой в равных частях по объёму (раствор 1:1:1).
    3. Нагрейте крышку в этом растворе 30 минут, пока раствор не начнёт пузыриться.
    4. Проверьте раствор и перемешивайте, аккуратно перемешивая каждые 10 минут, чтобы не склеивание слоев. При повороте раствора наблюдайте, как скольжи скользят друг от друга и затем отделяются. После разъединения постепенно замедляйте скорость, чтобы держать их на расстоянии, позволяя пузырящему раствору охватить слипы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор не следует нагревать слишком интенсивно, так как реакция образует тепло. Отрегулируйте плиту на мягкое пузырьканье, обычно на минимальной уровне. При таких настройках раствор остаётся на уровне ~70 °C. Также рекомендуется использовать свежую перекись водорода.
    5. Когда пройдёт 30 минут или когда раствор перестанет пузыриться, дайте раствору 1:1:1 остыть до комнатной температуры, затем тщательно промыть покрытие очищенной водой, мягко помешайте.
  2. УФ-озон
    1. Очистите кварцевые покрытия с помощью n-гексана, затем метанола, используя линзовые ткани.
    2. Поместите накладки в УФ-озоновый очиститель так, чтобы поверхность для обработки была обращена к лампе.
    3. Подать кислород в камеру с давлением 5 psi в течение 5 минут; Затем отключите подачу кислорода.
    4. Далее включите ультрафиолетовые лампы на 15 минут и оставьте чехлы минимум на 10 минут, чтобы озон вышёл.
    5. После использования любого из способов очистки обязательно сразу используйте очищенные накладки. Если используете ранее очищенные школьни, повторите процесс для восстановления поверхности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: УФ-озонация требует постоянной циркуляции для удаления озона из воздуха. Систему следует размещать под сноркелем для воздушной обработки или в вытяжке для выпаривающих газов.

4. Образование бислоя и включение AQP4 в двуслойную мембрану

ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер, использованный в этом исследовании, включал 100 мМ HEPES, 5 мМ CaCl2 и 140 мМ NaCl при pH 7,4.

  1. Поместите только что очищенный накладку в держатель для проба 25 мм с помощью 1/4-дюймовой трубки SM1. Затем вырежьте двухслойную прокладку из парапленки диаметром 8 мм и разместите её в центре держателя для образца (см. рисунок 3).
  2. Нанесите каплю 50 мкл внедорожников в центр прокладки 8 мм, запечатайте её, а затем инкубируете при 37 °C в течение 1 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет липосомам сливаться с гидрофильной поверхностью кварца и разрываться, образуя непрерывный бислой.
    Скорее всего, количество липосом, добавленных в область прокладки, может варьироваться, и для формирования непрерывного двухслойного прокладки может потребоваться больше липосом. Однако величины, указанные на шаге 4.2, почти всегда способствуют формированию непрерывного двухслойного слоя.
  3. После инкубации промывайте образец пипеткой, чтобы удалить раствор. Затем добавьте 50 мкл свежего буфера в бислой. Затем повторите процесс всего 10 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы кончик пипетки не касался липидного бислоя, и чтобы оставался раствор для поддержания гидратации. Если поднести кончик к верхней части капли, вы увидите, как она соприкасается с ним. Раствор можно удалить, не повредив бислой, если минимально контактировать с поверхностью капли. В конечном итоге капля переворачивается и направляется к прокладке; Это идеальный момент, чтобы прекратить удаление раствора. Отражённый свет должен измениться в этот момент и может служить сигналом остановиться. Если боитесь удаления слишком большого количества раствора, уменьшите настройку пипетки во время стирки, чтобы оставить комфортный буфер над липидным двуслоем.
    Целостность образования липидных бислоев в таких условиях может быть заранее оценена с помощью флуоресцентного восстановления после фотоотбеливания (FRAP). Для этого требуется наличие компонента в липидной смеси, который флуоресцентно маркируетсякак 6,7,24,25.
  4. После финальной промывки снова удалите буфер и добавьте 50 мкл аликвота желаемого белка в детергентном средстве при или ниже критической концентрации мицелляров. Дайте минимум 1 час для включения белка при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Моющее средство мягко размягчает двуслойный слой и помогает белку интегрироваться в мембрану. В этом протоколе использовался детергентный препарат 50 мкм n-додецилбета-D-тиомальтозид (DOTM), неионный детергент, а концентрация белка составляла 2 нм.
  5. Через час промите образец буфером, чтобы удалить несоставленные белки и моющее средство.
  6. Добавьте в образец 5 мг бусины с состоянием полистирола (Bio-beads), дайте постоять минимум 1 час перед извлечением. Образец затем готовится к визуализации (см. ниже).

5. Антифейдная добавка

  1. Растворить 5 мг тролокса и 80 мг D-глюкозы в 10 мл буфера (см. выше). Встряхивайте и вихрьте, пока не останется твердое тело. Нутатировать на ночь в темноте, затем фильтровать раствор через фильтр 0,22 мкм. Готовьте свежие блюда каждую неделю.
  2. Растворить 6,5 мг глюкозооксидазы (1650 U) и 8 мкл каталазы (29 200 мк/мл в буфере) в 92 мкл буфера. Аккуратно перемешайте раствор без вихря, затем центрифугуйте и перенесите супернатант в новую трубку. Храните при 4 °C и защищайте от света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно хранить в холодильнике несколько месяцев; Однако, если появится мутность, отбросьте её и приготовьте новый раствор.
  3. Смешайте 99 мкл раствора из 5.1 с 1 мкл из шага 5.2 в новую трубку. После финального промывания образца наносите сверху антифейдный раствор (называемый визуализационным раствором).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Антифейдные растворы могут изменять функции трансмембранных белков; Важно проверить совместимость с системой.

6. Настройка и настройки микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования на одной молекуле использовался специальный микроскоп TIRF. В этом разделе описываются основные компоненты и методы выравнивания ключей для базового флуоресцентного микроскопа, подходящего для быстрой таймлапс-визуализации (рисунок 4), который является надёжным инструментом.

  1. Используйте 633-нм лазер He:Ne для возбуждения образцов. Лазер проходит через полосный фильтр и 1/4 волновую пластину для очистки лазерной линии и преобразования возбуждения из линейно поляризованного света в кругово-поляризованный свет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Круговая поляризация уменьшает влияние ориентации зонда.
  2. Луч проходит через объектив диаметром 300 мм и лазерный линейный фильтр диаметром 633 нм, отражается от длиннопроходящего дихроического зеркала 633 нм и фокусируется на задней панели масляного микроскопа с 100x, 1,45 Н/А. Выровняйте балку, чтобы она плавно проходила через центр объектива и оставалась прямой при выходе из него.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе микроскоп настроен на эпифлуоресценцию (эпи). Небольшое количество сухого молока можно добавить в кювету с прозрачным дном. Затем кювету кладут на объектив микроскопа с каплей погружного масла между ними. Это позволяет наблюдать, что луч проходит прямо сквозь объектив.
  3. Излучение флуоресцентно маркированных белков проходит через объектив, дихроическое зеркало, длиннопроходящий фильтр и объектив диаметром 300 мм, затем снимается на камеру EMCCD. Используйте линзы с трубками с более длинным фокусным расстоянием для увеличения изображений на камере и повышения точности суперлокализации, что полезно для медленно движущихся трансмембранных белков и агрегатов. Обязательно калибруйте пиксели камеры в нанометры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Однако увеличение в 1x достигается с помощью трубочной линзы, указанной производителем объектива, что увеличивает отношение сигнал/шум за счёт фокусировки флуоресценции на меньшем числе пикселей. Распространённые фокусные расстояния включают объективы 200 мм, 180 мм, 165 мм и 164,5 мм. Мы рекомендуем использовать мишень увеличения ВВС США 1951 года. Используя объектив 300 мм в этой системе, калибровка пикселей 74 нм была измерена при общем увеличении 170x.
  4. Для контроля температуры образца можно с помощью объёмного воротника и держателя с нагревателем/охладителемПельтье 26.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание стабильной температуры крайне важно для обеспечения тепловой стабильности микроскопа и обеспечения точных температурно-зависимых измерений и фокусировки приборов.
  5. Пьезоприводы перемещают образец в направлениях XYZ. После того как образец в фокусе, настройте луч по краю объектива микроскопа (см. рисунок 4), используя ступень, прикреплённую к финальному поворотному зеркалу, до достижения критического угла. Это создаёт эванесцентное поле возбуждения. Микроскоп теперь установлен в TIRF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно определить, что микроскоп находится в TIRF, когда обратное отражение от лазера — это линия (а не пятно), а фон от образца уменьшается и удлиняется.

7. Сбор данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Камера должна быть настроена для быстрого сбора данных.

  1. Установите вертикальную скорость смещения пикселей примерно на 600 нс и разогните вертикальное тактовое напряжение (обычно +4). Затем установите горизонтальное считывание пикселей на максимальную (30 МГц при 16-битных частотах в этом примере). Отрегулировать усиление предусилителя на 2 и настроить выход усилителя для умножения электронов. Наконец, установить усиление умножителя электронов на максимальный уровень.
  2. Установите экспозицию на 25 мс. При экспозиции 25 мс убедитесь, что частота кадров немного выше (25,802 мс на используемой здесь камере).
  3. Настройте мощность лазера так, чтобы сигнал был чётко выше фона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Регулировать мощность лазера может быть сложно. Слишком высоко — и зонд быстро обесцвечивает; слишком низкий, а соотношение сигнал/шум затрудняет отслеживание. Рекомендуем установить мощность так, чтобы сигнал превышал фоновый уровень в 3-5 раз для частиц с самым слабым сигналом. Раздел 2 объясняет, почему молекулярная яркость показывает распределение.
  4. Соберите достаточно данных, чтобы обеспечить как минимум 1000 треков на выборку.

8. Анализ отслеживания

ПРИМЕЧАНИЕ: В наших лабораториях анализ отслеживания отдельных частиц обычно проводится с использованием индивидуальных скриптов в MATLAB на основе работ Крокера и Гриера и модифицированныхавторами 3,26,27. Ниже приведено описание с использованием ImageJ — бесплатно доступного программного обеспечения для исследовательского сообщества. Оба метода дают одинаковые результаты.

  1. Обрезайте наборы данных до единого размера, а затем корректируйте фон с помощью ImageJ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если собранные данные одинаковы между наборами, обрезать их нет необходимости. Обычно это делается только если область интереса на сенсоре камеры сдвинулась между сборами данных. Возможности ImageJ можно значительно расширить с помощью плагинов. Один из вариантов — установить и использовать FIJI, который представляет собой ImageJ в комплекте стандартных плагинов. Среди этих плагинов — TrackMate, который будет использоваться для протоколаздесь 28, 29.
    Сайт ImageJ Wiki предлагает прохождения и примеры для многих плагинов. Также включены видеоуроки.
  2. Внутри FIJI перетащите и опустите фильм или сложенный *.tif файл для анализа (см. Дополнительный файл 2).
  3. Введите данные калибровки пикселей. Во вкладке Анализ выберите Set Scale и примените калибровку пикселя к расстоянию для инструмента.
  4. Сохраните копию, чтобы отслеживать изменения по сравнению с оригиналом.
  5. Вычтите фон из выбранного окна и примените его к сохранённой копии оригинальных данных. Во вкладке «Процесс» выберите «Вычитать фон».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет оптимизировано на основе данных. Хорошей отправной точкой является использование «катящегося шара», который больше частиц, которые изображены.
  6. Во вкладке Плагины выберите Отслеживание | TrackMate. Это открывает диалоговое окно TrackMate , которое помогает пользователю пройти процесс отслеживания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения отслеживания можно экспортировать треки для дальнейшего анализа вне ImageJ.

9. Обработка данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь обсуждается, как обрабатывать репрезентативные данные и как рассчитывать распределения размера шагов и получать среднюю константу диффузии.

  1. Перетащите стек изображений в FIJI; Затем примените калибровку (74 нм/пиксель).
  2. Вычтите фон с помощью вычитания катящегося шара шириной 5 пикселей. Разделите поле на четыре отдельных участка размером 11 мкм x 11 мкм и проанализируйте отдельно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо для минимизации пороговой дисперсии, вызванной полем возбуждения при отслеживании мембранных белков.
  3. Запустите плагин TrackMate . Убедитесь, что калибровка применена к пикселям (см. Дополнительный файл 3) и что время охватывает желаемый диапазон.
    1. В TrackMate выберите лапласиан гаусса (LoG) в качестве метода обнаружения частиц с оценочным диаметром 350 нм с использованием медианного фильтра предварительной обработки. Нажмите кнопку предпросмотра , чтобы убедиться, что обнаруженные частицы разумны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые частицы могут явно находиться на заднем плане; Не переживайте об этом — они будут устранены на следующем этапе.
    2. Когда настройки подсчёта удовлетворяются, обрабатывайте остальную часть стека, затем проводите пороговое определение. Используйте автоматическое изменение порога или перетащите поле выбора для регулировки порога.
    3. После выбора способа визуализации обнаруженных частиц выберите метод отслеживания: Advanced Kalman Tracker для этого набора данных со следующими настройками: 350 нм для радиусов поиска и максимальный разрыв кадров 2 кадра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также возможно добавить штрафы, разделение трасс и слияние трасс. Для этого набора данных проводилось только отслеживание.
    4. Решите, как фильтровать и визуализировать треки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом наборе данных отображаются только обнаруженные точки (см. Дополнительный файл 4).
    5. После обработки отдельных треков экспортируйте данные отслеживания в XML-файл для использования в программном обеспечении редактирования таблиц (см. Дополнительный файл 5).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как описано в разделе 2 протокола, лизины маркировались с использованием NHS-эфиров, конъюгированных с флуоресцентной красителем (NHS-красителем). После конъюгации с белком измеряйте DOL с помощью UV-Vis спектрометра. Для этого эксперимента DOL тетрамеров AQP4 составил 4,12. Далее определите вероятность того, что каждый тетрамер AQP4 будет иметь хотя бы одну молекулу красителя, используя распределение Пуассона, приведённое ниже.

figure-results-1(2)

Где P — вероятность того, что каждый AQP4 будет помечен, используя уравнение 2, вероятность того, что к каждому тетрамеру AQP4 прикреплена флуоресцентная метка, равна 98%. Распределение меток на тетрамер показано на рисунке 2 и отражает распределение яркости, наблюдаемое в образце.

Соотношение сигнал/шум, достигнутое в данном примере, составляло 8-9 раз выше фона для одного флуорофора и более 15-20 для самых ярких частиц. Эта дисперсия обусловлена положением в пучке возбуждения и DOL, описанных на шаге 2 протокола.

Внутри сгенерированного XML-файла интересующие столбцы — J, K, L и M, которые соответствуют идентификатору номера частицы, кадру, в котором была обнаружена частица, позиции X частицы и позиции Y частицы соответственно (см. дополнительный файл 6). На втором листе файла рассчитываются распределение размеров шагов и средний коэффициент диффузии, где размеры шагов — это расстояния, на которые частица проходит между кадрами, а среднее диффузия задаётся уравнением 3:

figure-results-2(3)

где Dave — средний коэффициент диффузии, а Δt — частота кадров. Это уравнение предполагает броуновское движение, что обычно справедливо для малых перемещений и может быть подтверждено анализом метки среднего квадрата смещения по времени по выборкеотдельных треков 3,30,31.

Гистограмма шаговых размеров показывает распределение диффузирующих частиц, что можно отнести к OAP разного размера (рисунок 5).

figure-results-3
Рисунок 1: Аппарат для сушки липидов. Устройство состоит из колбы с круглым дном объемом 10 мл и вакуумным дистилляционным разъёмом. Азот поступает под низким давлением через шприцовый фильтр 0,2 мкм с иглой, прикреплённой к жёлтой синтезирующей крышке, соединённой с вакуумным дистилляционным разъемом. Давление выпускается через трубку Tygon, прикреплённую к шприцу с помощью отрезающей игли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 2: Ожидаемое распределение флуоресцентных меток на каждой единице AQP4 с использованием уравнения 2. Самое вероятное число флуорофоров — 4, и 98% всех AQP4 имеют флуоресцентную метку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 3: Сборка держателя образца. Сборка состоит из трубки линзы SM1 диаметром 1" с удаленной мужской резьбой и скошенной, чтобы предотвратить помехи с объективом микроскопа. Включает кварцевую крышку и прокладку парапленки. Вся конструкция закреплена фиксирующим кольцом SM1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 4: Микроскоп .Справа — упрощённая схема микроскопа; Зелёная линия показывает возбуждающий свет, исходящий от лазера. Начиная справа, лазерный свет проходит через 1/4 волновой пластины, затем фокусируется объективом 300 мм. Свет отражается длиннопроходящим дихроичным зеркалом на объектив, где фокусируется на заднем отверстии. Используя зеркало сдвига пучка возбуждения, пучок располагается на краю апертуры объектива, создавая эванесцентное поле в образце. Свет, излучаемый в фокусе, собирается объективом и обозначается красной линией. Затем излучаемый свет проходит через дихроик, затем через длиннопроходящий фильтр и фокусируется объективом 300 мм на камеру, обеспечивая оптическое увеличение в 1,7 раза (общее увеличение 170-кратное по сравнению с объективом и трубкой). Слева — изображение микроскопа. Обратите внимание, что для правильного позиционирования лазера используются дополнительные поворотные зеркала. Одновременно детектирующая рука располагается так, чтобы максимизировать сбор фотонов из флуоресцентно маркированных трансмембранных белков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-7
Рисунок 5: Гистограмма размеров шагов. Синяя линия с красными кругами — это гистограмма всех размеров шагов. Чёрная линия подходит для множественных коэффициентов диффузии. Вероятностное распределение размера шагов задаётся следующим образом: figure-results-8 где fi — дробная популяция каждого типа диффундирующей частицы, при условии, что каждая из них подвергается броуновскому движению. Гистограмма и подгонка показывают гетерогенное распределение более медленно и быстро движущихся частиц, что объясняется распределением нескольких размеров OAP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1: Калькулятор электронных таблиц для определения состава mol%, общего количества липидов и опциональных флуоресцентных/FRAP-компонентов для подготовки внедорожника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Необработанный стек изображений с одномолекулярной флуоресцентной микроскопией, используемый для отслеживания траектории (исходный файл для учебника по TrackMate). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 3: Анимированный предпросмотр исходных одномолекулярных флуоресцентных данных, показывающих интенсивность и фон до обработки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 4: Анимация отфильтрованных путей частиц (после порогового определения), показывающая репрезентативные траектории AQP4 со временем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 5: Анимированное наложение, показывающее полное отслеживание частиц молекул AQP4 с использованием выхода TrackMate. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 6: Таблица, показывающая извлечённые координаты траектории и рассчитанные распределения размера шагов, используемые для анализа диффузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем метод отслеживания отдельных частиц для прямого наблюдения отдельных мембранных белков, когда они проходят через твердо поддерживаемую липидную бислойную мембрану и взаимодействуют друг с другом. AQP4 был выбран в качестве репрезентативного примера из-за способности формировать динамические самосборки, регулируемые различнымиизоформами 32, 33, 34. Выше мы описываем надёжный метод подготовки образцов и ключевые параметры для отслеживания одномембранных белков на миллисекундных временных масштабах. Этапы включают: (1) подготовку внедорожников, (2) определение соответствующего уровня флуоресцентной маркировки, (3) подготовку твёрдых опор, (4) создание трансмембранных образцов белков внутри твёрдого липидного бислоя, (5) подготовку антифейдных агентов, (6) создание простого одномолекулярного микроскопа, (7) сбор данных отслеживания одной молекулы и (8) анализ данных отслеживания с помощью ImageJ.

Описанный пошаговый метод концептуально прост; однако каждый критический шаг имеет свои подводные камни и ограничения. Среди них подготовка образцов наиболее сложна (шаги 1-5). Поэтому следует учитывать несколько деталей. Первое — как создать крепкий липидный бислой. Существует три основных метода: (1) Langmuir-Blodgett (LB), (2) слияние и разрыв внедорожника, и (3) спиновоепокрытие 35, 36, 37, 38, 39. У каждого метода есть свои плюсы и недостатки. Например, метод Лангмюра–Блоджетта обеспечивает больший контроль над свойствами и химическим составом бислоев, включая асимметричный состав между двумя листочками, и позволяет формировать многослойные слои контролируемым способом. Однако использование LB-жолоба технически требовательно, занимает много времени и дорого для приобретения35. Спин-покрытие — это относительно простая техника создания липидных бислоев; однако он обычно производит многослойные материалы и требует большого избытка материала, часто непрактичнобольшого количества 39. Слияние и разрыв везикул — это простые процессы, требующие лишь небольшое количество материала. Однако создание гидрофильной поверхности крайне важно, и некоторые липидные составы легче формируют бислои путём слияния везикул (например, в нашей лаборатории мы обнаружили, что везикулы с чистым отрицательным зарядом образуют бислои путём слияния везикул только при добавлении двухвалентных катионов и увеличенного времени инкубации)40. Помимо создания гидрофильной поверхности (шаг 3), другие важные аспекты при формировании твёрдого двухслойного слоя путём фузикулного синтеза включают промывку нового бислоя как до, так и после включения мембранного белка. Предварительное промывка удаляет излишки SUV и крупные мультиламеллярные везикулы (MLV), а финальная промывка после установки мембраны удаляет неинкорпорированные белки. Недостаточная промывка может создавать фоновые сигналы во время трекинговых исследований.

Мы провели скрининг множества детергентов, чтобы определить, подходят ли они для трансмембранного введения белков в твердо поддерживаемые липидные бислои, включая C12E9, Tween-20, TritonX-100 и многие другие. Наш предпочитаемый моющий препарат — DOTM, потому что его легко удалять и он наиболее бережно влияет на мембрану (меньше рискует нарушать целостность мембраны). Количество добавленного белка имеет решающее значение. Если слишком много, будет невозможно наблюдать отдельные дорожки. При адаптации этой процедуры к другим трансмембранным белкам количество придётся корректировать методом проб и ошибок. Тем не менее, указанные в этой процедуре величины являются отличной отправной точкой. Количество моющего средства должно оставаться на уровне или ниже критической концентрации мицелляров; в противном случае двуслойный слой растворится и удаляется из кварцевого субстрата.

Введение мембранных белков в поддерживаемый липидный бислой необходимо оптимизировать для каждого набора экспериментальных условий. Однако существует несколько распространённых методов для достижения этого, включая использование протеолипосом и прямое включение мембранных белков в готово сформированныйбислой 41. Протеолипосома — это липосома, например внедорожник, в которую встроен белок. Эти протеолипосомы могут сливаться с готово сформированным твердоопорным липидным бислоем или интегрироваться одновременно с SUV при формированиибислоя 42. Слияние вызывает разрыв, высвобождая белок в мембрану. Он прост в реализации, но приводит к случайной ориентации белков мембраны. Это может привести к сильным взаимодействиям с твёрдой опорой, что приводит к различным диффузионным свойствам в зависимости от ориентациибелка 3. Этот протокол описывает метод, использующий прямое включение, что даёт ориентационное предпочтение AQP4 и другим мембранным белкам с крупными гидрофильными доменами на одной сторонебелка 2,5,43,44.

Прямое наблюдение — мощный инструмент, используемый в научных открытиях. Динамическая мономолекулярная визуализация особенно важна в биофизике мембран-белок, где наблюдение за движением и взаимодействием отдельных белков используется для проверки гипотез или создания новых, которые лучше описывают поведение белка. Описанные здесь протоколы и методы идеально подходят для двумерных твердо-поддерживаемых липидных бислоев, но могут быть расширены на более сложные среды с несколькимикомпонентами 2, живымиячеками 34, 45, 46, 47 и тремяизмерениями 48. Отслеживание одной молекулы открывает двери для множества других экспериментов, включая двухцветное отслеживание с одной молекулой49, одномолекулярное FRET 50,51 и динамическую сверхразрешающую визуализацию, такую как стохастическая оптическая реконструкция микроскопии (STORM) и наномасштабная топография с накопительным изображением (PAINT). Расширяя прибор с добавлением системы контроля температуры, можно также исследовать термодинамические свойства мембранныхбелков 26,43,52.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Управлением научных исследований ВВС FA9550-20-1-0324, FA9550-23-1-0583 (J.A.B. и G.P.N.) и FA9550-18-1-0395 (J.A.B.).

G.P.N. признаёт следующие финансовые организации:
(1) NEXTGENERATIONEU (NGEU), финансируемый Министерством университетов и исследований (MUR), Национальный план восстановления и устойчивости (NRRP), проект MNESYS (PE0000006) — Комплексный многомасштабный подход к изучению нервной системы в области здоровья и заболеваний (DD No 1553, 11.10.2022)
(2) NEXTGENERATIONEU (NGEU), финансируемый Министерством университетов и исследований (MUR), Национальный план восстановления и устойчивости (NRRP), проект CN_00000041 — Национальный центр генной терапии и лекарств на основе РНК-технологий (DD n.1035, 17.06.2022).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1/4 волновой пластиныТорлабыWPQ05M-633Обязательно подберите лазер
100X Oil ObjectiveОлимп12-563-6591.45 N/A апохроматика
16:0-18:1 ПКAvanti Polar Lipids850457Фосфолипиды POPC
18:0 PEG2000 физкультуреAvanti Polar Lipids880210Аммоничная соль
Объектив 300 ммТорлабыAC254-300-A-ML
633 нм He:Ne лазерМеллес Грио05-LHP-927Можно менять на другие источники и на другие длины волн
633-нм полосный фильтрChroma Tech633/10XСовпадение с используемым лазером
Длинночастотный фильтр 655 нмChroma TechET655lpИзмените длины волн красителя/лазера
Андор Солис IAndor Андор Солис IПрограммное обеспечение для захвата изображений
ATTO 655 ATTO-TEC655 год н.э.Модификация NHS-эфира — любое краситель с модификацией, подходящей для работы с одной молекулы, может использоваться. Рекомендуется ATTO, но можно использовать Cy5/7
Биошарики SM-2 смолаBioRad1523922
Хлорид кальцияМиллипор СигмаC4901
КаталазеСигма-ОлдричC3155-50MGиз печени крупного рогатого скота, водного солтиона и ге; 30000 единиц на мг
ХлороформFisher Scientific C547-1HPLC или спектроскопический класс
ХолестеринСигма-ОлдричC8667-500MG
КоверслипыESCO OpticsR52500025 мм кварц
Дихроичный расщепитель лучейСемрокFF545/650-Di01-25x36Измените длины волн красителя/лазера
Камера EMCCDAndor iXon Ultra 888
Falcon Tubes 15 мл Bio-one Грейнера188261Клеточные культивные трубки Cellestar
ГлюкозооксидазаСигма-ОлдричG2133-50KUот Aspergillus niger, typer VII и ge; 100000 единиц на г твердое тело (без добавления кислорода)
Тепловой пистолетHarbor Freight56434Для нагрева парапленки обычно можно было использовать любой тепловой пистолет
HEPESБиореагенты FisherBP310-500
Масло с низкой автофлуоресценцией погруженияТорлабыMOIL-30
МетоналFisher Scientific A452-1HPLC или спектроскопический класс
Микроцентрифуга-трубкаVMR525-11261,5 млн мл 
МикропипеткиЭпендорфРазные; 1000 и микро; L, 100 и микро; L и 10 и микро; В предложении
и Ослэш; Трубки объективов диаметром 1,5"ТорлабыSM1.5L10Внешняя нить урезается для подготовки образцов
Оптическая таблицаНьюпортRPR RelianceРазмер табеля зависит от доступного пространства
Оптические тканиТорлабыMC-50EОчистка различных компонентов
ПарафильмМиллипор СигмаP7669Убедитесь, что во время процесса нет флуоресцентных газов
ПьезоприводНьюпортPZA12
Пневматические изоляторы вибрацииНьюпортСерия I-2000используется для стабилизации оптической таблицы на наличие любых неравномерностей 
Рефрижераторная ваннаFisher Scientific Isotemp 3016
Контроллер затвораТорлабыSC10Связано с программным обеспечением для визуализации
Хлорид натрияМиллипор СигмаS988
Стеритоп фильтрМиллипор СигмаS2GPT05RE
Драйвер и контроллер Switchbox НьюпортPZC200Контроллер сцены
Фильтр для шприцевДж.Т. БейкерSF01-98PES 25mm 0.2 & micro; M
Элемент TECТорлабыTEC3-2.5Используется для соединения теплового насоса Peltirer с держателем образца и воротником объектива
Температурный контроллерMeerstetter EngineeringTEC-1091
Детектор температурыТорлабыTH100PT
ТермисторТорлабыTH10K
Трубочный диализаторG Biosciences786-6114K MWCO
УФ-озоночистительNovascanPSDP_UVPro Series — Digital 
Zoom Optics ТорлабыSM1NR1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fitzner, D., et al. Cell-type- and brain-region-resolved mouse brain lipidome. Cell Rep. 32 (11), 108132(2020).
  2. Barnaba, C., Taylor, E., Brozik, J. A. Dissociation constants of cytochrome P450 2C9/cytochrome P450 reductase complexes in a lipid bilayer membrane depend on NADPH: a single-protein tracking study. J Am Chem Soc. 139 (49), 17923-17934 (2017).
  3. Poudel, K. R., Keller, D. J., Brozik, J. A. Single particle tracking reveals corralling of a transmembrane protein in a double-cushioned lipid bilayer assembly. Langmuir. 27 (1), 320-327 (2011).
  4. Diaz, A. J., Albertorio, F., Daniel, S., Cremer, P. S. Double cushions preserve transmembrane protein mobility in supported bilayer systems. Langmuir. 24 (13), 6820-6826 (2008).
  5. Barnaba, C., Martinez, M. J., Taylor, E., Barden, A. O., Brozik, J. A. Single-protein tracking reveals that NADPH mediates the insertion of cytochrome P450 reductase into a biomimetic of the endoplasmic reticulum. J Am Chem Soc. 139 (15), 5420-5430 (2017).
  6. Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. Photobleaching assays (FRAP & FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells. J Vis Exp. (52), e2696(2011).
  7. Zheng, C. -Y., Petralia, R. S., Wang, Y. -X., Kachar, B. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence-tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons. J Vis Exp. (50), e2568(2011).
  8. Khaw, I., et al. Flat-field illumination for quantitative fluorescence imaging. Opt Express. 26 (12), 15276-15288 (2018).
  9. Carder, J. D., et al. Thermodynamics and S-palmitoylation dependence of interactions between human aquaporin-4 M1 tetramers in model membranes. J Phys Chem B. 128 (3), 603-621 (2024).
  10. Saadoun, S., Papadopoulos, M. C. Aquaporin-4 in brain and spinal cord oedema. Neuroscience. 168 (4), 1036-1046 (2010).
  11. Mader, S., Brimberg, L. Aquaporin-4 water channel in the brain and its implication for health and disease. Cells. 8 (2), (2019).
  12. Salman, M. M., et al. Emerging roles for dynamic aquaporin-4 subcellular relocalization in CNS water homeostasis. Brain. 145 (1), 64-75 (2021).
  13. Graber, D. J., Levy, M., Kerr, D., Wade, W. F. Neuromyelitis optica pathogenesis and aquaporin-4. J Neuroinflammation. 5 (1), 22(2008).
  14. Zamvil, S. S., Slavin, A. J. Does MOG-Ig-positive AQP4-seronegative opticospinal inflammatory disease justify a diagnosis of NMO spectrum disorder. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2 (1), e62(2015).
  15. Takahashi, T., et al. Anti-aquaporin-4 antibody is involved in the pathogenesis of NMO: a study on antibody titre. Brain. 130 (Pt 5), 1235-1243 (2007).
  16. Ho, J. D., et al. Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 Å and its mechanism of conductance. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7437-7442 (2009).
  17. Crane, J. M., Verkman, A. S. Reversible, temperature-dependent supramolecular assembly of aquaporin-4 orthogonal arrays in live cell membranes. Biophys J. 97 (11), 3010-3018 (2009).
  18. Crane, J. M., Verkman, A. S. Determinants of aquaporin-4 assembly in orthogonal arrays revealed by live-cell single-molecule fluorescence imaging. J Cell Sci. 122 (6), 813-821 (2009).
  19. Jin, B. -J., Rossi, A., Verkman, A. S. Model of aquaporin-4 supramolecular assembly in orthogonal arrays based on heterotetrameric association of M1-M23 isoforms. Biophys J. 100 (12), 2936-2945 (2011).
  20. Hamai, C., Cremer, P. S., Musser, S. M. Single giant vesicle rupture events reveal multiple mechanisms of glass-supported bilayer formation. Biophys J. 92 (6), 1988-1999 (2007).
  21. Kurniawan, J., Ventrici De Souza, J. F., Dang, A. T., Liu, G. -Y., Kuhl, T. L. Preparation and characterization of solid-supported lipid bilayers formed by Langmuir-Blodgett deposition: a tutorial. Langmuir. 34 (51), 15622-15639 (2018).
  22. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. In Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
  23. Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).
  24. Barnaba, C., Martinez, M. J., Taylor, E., Barden, A. O., Brozik, J. A. Single-protein tracking reveals that NADPH mediates the insertion of cytochrome P450 reductase into a biomimetic of the endoplasmic reticulum. J Am Chem Soc. 139 (15), 5420-5430 (2017).
  25. Barnaba, C., Taylor, E., Brozik, J. A. Dissociation constants of cytochrome P450 2C9/cytochrome P450 reductase complexes in a lipid bilayer membrane depend on NADPH: a single-protein tracking study. J Am Chem Soc. 139 (49), 17923-17934 (2017).
  26. Martinez, M. J., et al. Thermodynamic driving forces of redox-dependent CPR insertion into biomimetic endoplasmic reticulum membranes. J Phys Chem B. 126 (5), 1141-1151 (2022).
  27. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. J Colloid Interface Sci. 179 (1), 298-310 (1996).
  28. Ershov, D., et al. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nat Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  29. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Poudel, K. R., Keller, D. J., Brozik, J. A. The effect of a phase transition on single molecule tracks of annexin V in cushioned DMPC assemblies. Soft Matter. 8 (44), 11285-11293 (2012).
  31. McCain, K. S., Hanley, D. C., Harris, J. M. Single-molecule fluorescence trajectories for investigating molecular transport in thin silica sol-gel films. Anal Chem. 75 (17), 4351-4359 (2003).
  32. Loughran, G., et al. Evidence of efficient stop codon readthrough in four mammalian genes. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8928-8938 (2014).
  33. Crane, J. M., Verkman, A. S. Reversible, temperature-dependent supramolecular assembly of aquaporin-4 orthogonal arrays in live cell membranes. Biophys J. 97 (11), 3010-3018 (2009).
  34. Crane, J. M., Van Hoek, A. N., Skach, W. R., Verkman, A. S. Aquaporin-4 dynamics in orthogonal arrays in live cells visualized by quantum dot single particle tracking. Mol Biol Cell. 19 (8), 3369-3378 (2008).
  35. Kurniawan, J., Ventrici De Souza, J. F., Dang, A. T., Liu, G. -Y., Kuhl, T. L. Preparation and characterization of solid-supported lipid bilayers formed by Langmuir-Blodgett deposition: a tutorial. Langmuir. 34 (51), 15622-15639 (2018).
  36. Lind, T. K., Cárdenas, M., Wacklin, H. P. Formation of supported lipid bilayers by vesicle fusion: effect of deposition temperature. Langmuir. 30 (25), 7259-7263 (2014).
  37. Hardy, G. J., Nayak, R., Zauscher, S. Model cell membranes: techniques to form complex biomimetic supported lipid bilayers via vesicle fusion. Curr Opin Colloid Interface Sci. 18 (5), 448-458 (2013).
  38. Simonsen, A. C., Bagatolli, L. A. Structure of spin-coated lipid films and domain formation in supported membranes formed by hydration. Langmuir. 20 (22), 9720-9728 (2004).
  39. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating. Langmuir. 18 (21), 8172-8177 (2002).
  40. Silva-López, E. I., Edens, L. E., Barden, A. O., Keller, D. J., Brozik, J. A. Conditions for liposome adsorption and bilayer formation on BSA-passivated solid supports. Chem Phys Lipids. 183, 91-99 (2014).
  41. Granéli, A., Rydström, J., Kasemo, B., Höök, F. Formation of supported lipid bilayer membranes on SiO2 from proteoliposomes containing transmembrane proteins. Langmuir. 19 (3), 842-850 (2003).
  42. Puu, G., Artursson, E., Gustafson, I., Lundström, M., Jass, J. Distribution and stability of membrane proteins in lipid membranes on solid supports. Biosens Bioelectron. 15 (1), 31-41 (2000).
  43. Davis, R. W., et al. Nanoporous microbead supported bilayers: stability, physical characterization, and incorporation of functional transmembrane proteins. Langmuir. 23 (7), 3864-3872 (2007).
  44. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  45. Zepernick, A. -L., et al. Single-molecule imaging of aquaporin-4 array dynamics in astrocytes. Nanoscale. 16 (19), 9576-9582 (2024).
  46. Verkman, A. S., Rossi, A., Crane, J. M. Methods Enzymol. 504, 341-354 (2012).
  47. Tajima, M., Crane, J. M., Verkman, A. S. Aquaporin-4 (AQP4) associations and array dynamics probed by photobleaching and single-molecule analysis of green fluorescent protein-AQP4 chimeras. J Biol Chem. 285 (11), 8163-8170 (2010).
  48. Nguyen, T. D., Chen, Y. -I., Chen, L. H., Yeh, H. -C. Recent advances in single-molecule tracking and imaging techniques. Annu Rev Anal Chem. 16, 253-284 (2023).
  49. Schirripa Spagnolo, C., Moscardini, A., Amodeo, R., Beltram, F., Luin, S. Optimized two-color single-molecule tracking of fast-diffusing membrane receptors. Adv Opt Mater. 12 (9), 2302012(2024).
  50. Bartels, K., Lasitza-Male, T., Hofmann, H., Löw, C. Single-molecule FRET of membrane transport proteins. ChemBioChem. 22 (17), 2657-2671 (2021).
  51. Sasmal, D. K., Pulido, L. E., Kasal, S., Huang, J. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer in molecular biology. Nanoscale. 8 (48), 19928-19944 (2016).
  52. Lam, K. T., et al. Direct measurement of single-molecule ligand-receptor interactions. J Phys Chem B. 124 (36), 7791-7802 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Protein TrackingLipid BilayersFluorescence MicroscopyMembrane ProteinsSingle Molecule ImagingTime Lapse ImagingAquaporin 4Protein DiffusionBiomimetic MembranesTrackMate Analysis

Related Articles