Методическая статья

Моделирование митохондриальных заболеваний с использованием органоидов головного мозга: акцент на митохондриальную энцефаломиопатию, лактатацидоз и инсультоподобные эпизоды

DOI:

10.3791/69303

⸱

10 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Kitasato University School of Medicine, 2Molecular Genetics Unit, Kitasato University Graduate School of Medical Science, 3Department of Otolaryngology, Head & Neck Surgery, Gene Therapy for Hearing Impairment and Deafness, Tübingen Hearing Research Center, University of Tübingen, 4Department of Physiology, Keio University School of Medicine, 5Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University Medical Center, 6Institute for Disease Modeling, Kurume University School of Medicine, 7Department of Diabetes, Endocrinology and Nutrition, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 8Department of Clinical Biology and Hormonal Regulation, Tohoku University Graduate School of Medicine, 9Keio University Regenerative Medicine Research Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органоиды мозга служат ценной моделью для исследований митохондриальной энцефаломиопатии, лактоацидоза и инсультоподобных эпизодов (MELAS), предлагая понимание лежащей в их основе патофизиологии и обеспечивая платформу для скрининга лекарств. Органоиды, полученные из клеточных линий с различными уровнями гетероплазмии генов, вызывающих заболевания, демонстрируют значительные фенотипические различия.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондриальная энцефаломиопатия, лактоацидоз и инсультоподобные эпизоды (MELAS) являются митохондриальными нарушениями, наиболее часто вызываемыми вариантом m.3243A>G в митохондриальной тРНКLeu. Чтобы исследовать патофизиологию MELAS, мы создали органоиды мозга из нескольких линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), полученных от пациента с MELAS, несущего вариант m.3243A>G. Эти линии имеют идентичный ядерно-генетический фон, но различаются по уровням гетероплазмии, включающей вариант m.3243A>G. Мы наблюдали значительные различия в размере, морфологии органоидов и эффективности нейронной индукции, которые коррелировали со степенью гетероплазмии. Диссоциированные нейроны из органоидов были перенесены в 2D-культуральную систему, которая удобна и подходит для высокопроизводительного скрининга лекарств. Органоиды также продемонстрировали существенные различия в формировании нейронных сетей в зависимости от уровня гетероплазмии. Наши результаты свидетельствуют о том, что модели органоидов на основе ИПСК, полученные от пациентов, представляют собой полезную платформу для изучения механизмов MELAS и для скрининга лекарственных препаратов. В этом видео представлены комплексные и удобные для пользователя методы, включая протоколы генерации органоидов и оценки фенотипов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондриальная миопатия, энцефалопатия, лактоацидоз и инсультоподобные эпизоды (МЕЛАС) — это митохондриальные заболевания, которые характеризуются неврологической дисфункцией, инсультоподобными эпизодами и различными системными симптомами. Наиболее частой причиной является вариант m.3243A>G в гене тРНК митохондриального лейцина, MT-TL11. Считается, что этот вариант нарушает модификацию таурина на антикодоне, тем самым снижая эффективность трансляции лейцина и способствуя митохондриальной дисфункции при MELAS 2,3,4. Примечательно, что сообщалось об улучшении симптомовпосле приема высоких доз таурина. Тем не менее, наличие пациентов, не отвечающих на лечение, позволяет предположить, что дополнительные, пока еще не идентифицированные, патофизиологические механизмы могут способствовать заболеванию у лиц, являющихся носителями варианта m.3243A>G.

Для выяснения механизмов заболевания, вызванного генетическими вариантами, идеально использовать экспериментальные модели, в которых все переменные идентичны, за исключением причинного варианта, что позволяет проводить точные фенотипические сравнения. Отредактированные геномом клеточные линии и животные модели с скорректированными вариантами часто используются в качестве контроля для выявления нарушений ядерных генов. Тем не менее, репарация вариантов мтДНК остается технически сложной задачей, даже при использовании передовых технологий редактированиягенома 7. Поэтому создание экспериментальных моделей с идентичным ядерным фоном остается сложной задачей. Чтобы решить эту проблему, мы использовали две линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), полученные от одного и того же пациента с MELAS, которые различаются только по уровню гетероплазмии (т.е. доле митохондриальной ДНК, несущей MT-TL1 m.3243A>G вариант8), и сгенерировали органоиды мозга в качестве модели заболевания. Несмотря на то, что уровни гетероплазмии могут колебаться во время прохождения или дифференцировки клеток, потенциально влияя на фенотипы и вызывая вариабельность результатов экспериментов от партии к партии, клетки, полученные от пациентов, несущие варианты митохондриальных генов, остаются ценными для изучения патогенеза заболевания.

В этом исследовании мы создали органоиды мозга из ИПСК пациента, полученного от пациента с MELAS, и исследовали их патофизиологию, чтобы лучше понять механизмы заболевания. Используя две линии iPSC с высоким и низким уровнями гетероплазмии, мы наблюдали значимые различия в эффективности нейронной индукции, которые коррелировали со степенью гетероплазмии. Наши результаты свидетельствуют о том, что органоиды мозга, полученные от пациентов, обеспечивают ценную платформу для выяснения механизмов, лежащих в основе MELAS, и для облегчения скрининга лекарственных средств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Две линии iPSC (2-6 и 2-8) были получены из фибробластов одного и того же пациента MELAS с использованием хорошо зарекомендовавших себя методов8. Они различаются только по уровню гетероплазмии. В качестве контроля использовали линию 414C2 iPSC, полученную от здорового человека. Протокол, использованный в этом исследовании, соответствовал рекомендациям Комитета по этике Медицинской школы Университета Китасато (#G22-02).

1. Культура клеток

  1. Размораживание запасов замороженных элементов
    1. Подготовьте 6-луночные планшеты, покрыв их ламинином в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Нагрейте питательную среду для получения ИПСК без питательных веществ, содержащих 10 мкМ ингибитор ROCK, до 37 °C.
    3. Достаньте замороженный флакон с iPSC из резервуара с жидким азотом (LqN2) и быстро разморозьте на водяной бане при температуре 37 °C.
    4. Перелейте размороженную суспензию в 10 мл предварительно прогретой среды. Центрифугировать при 120 × г в течение 5 мин при комнатной температуре (22 °C).
    5. Осторожно извлеките надосадочную жидкость и аккуратно суспендируйте гранулу, постукивая по трубке. Добавьте свежие клетки среды и семян в 6-луночные планшеты, предварительно покрытые ламинином. Инкубировать при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%CO2.
  2. Изменение среды
    1. Заменяйте среду (без ингибитора ROCK) каждые 1-2 дня.

2. Генерация церебральных органоидов

  1. Начало дифференциации (День 0)
    1. Удалите среду из культуральных планшетов iPSC (~70-80% confluent). Промойте камеры PBS.
    2. Добавьте раствор фермента и выдерживайте при 37 °C в течение 5 минут.
    3. Добавьте среду, чтобы остановить реакцию. Перенесите клетки в пробирку объемом 15 мл. Центрифугировать при 190 × г в течение 5 мин при комнатной температуре (22 °C).
    4. Ресуспендировать гранулу в 1 мл дифференцировочной среды, содержащей 30 мкМ ингибитора ROCK, 5 мкМ SB431542 и 2,5 мкМ IWP-2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Базовая среда такая же, как и в шаге 1.1.2.
    5. Посчитайте клетки. Затравите 3 × 103 ячейки по 100 мкл в лунку в U-образные, 96-луночные, низкоадгезионные пластины. Инкубировать в течение 6 дней при 37 °C, 5% CO2.
  2. Средние изменения (День 6)
    1. Перенесите органоиды (из шага 2.1.5) из 96-луночного планшета в чашку диаметром 10 см с помощью пипетки с широким отверстием. Добавьте 50 мкл среды (DMEM/F12 с 1% N2, 1% заменителя глутамина, 1% NEAA, 2,5 мкМ IWP-2, 5 мкг/мл гепарансульфата и 1% PS) в каждую лунку нового 96-луночного планшета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пипетки с широким отверстием на протяжении всего эксперимента при переносе органоидов, чтобы не нарушить их 3D-структуру. Кроме того, 8-канальные пипетки полезны для быстрого и точного проведения экспериментов.
    2. Соберите органоиды в пробирки объемом 2 мл. Осторожно удалите среду, чтобы не допустить аспирации органоидов и добавьте 1,5 мл DMEM/F12. Повторите 3 раза, чтобы промыть органоиды.
    3. Удалите среду и добавьте 500 μл свежей среды в пробирки с органоидами. Переложите все органоиды в чашку 10 см, затем добавьте 5 мл среды, чтобы было легче собрать каждый органоид.
    4. Возьмите один органоид с помощью микропипетки, отрегулированной на 50 μл, и перенесите его в одну лунку 96-луночного планшета. Повторяйте до тех пор, пока все органоиды не будут перенесены на 96-луночный планшет (конечный объем 100 мкл). Инкубировать в течение 3 дней при 37 °C, 5% CO2.
  3. Средняя смена (День 9)
    1. (Дополнительный) Переносите органоиды в 10-сантиметровую чашку при использовании 8-канальных пипеток. Пропустите шаг 2.3.1 при использовании одноканальных микропипеток и перейдите к шагу 2.3.2.
    2. Соберите органоиды в пробирки объемом 2 мл. Постирайте 3 раза с DMEM/F12 как шаг 2.2.2.
    3. Ресуспендировать в дифференцировочной среде (1:1 DMEM/F12 и нейробазальной), содержащей 1% N2, 2% B27 без витамина А, 100 мкМ 2-меркаптоэтанола (ME), 2,5 мкг/мл инсулина, 1% заменителя глютамина, 0,5% NEAA и 1% экстракта базальной мембраны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте небольшие аликвоты экстракта базальной мембраны для одноразового использования и храните при температуре -20 °C до тех пор, пока не понадобится. Разморозьте экстракт при температуре 4 °C, не допуская, чтобы он превысил 8 °C, затем смешайте его с холодной средой и нагревайте среду при комнатной температуре в течение примерно 30 минут.
    4. Перенесите ~10 органоидов на лунку в 6-луночный планшет. Итоговый объем среды на 1 лунку отрегулируйте до 2 мл. Культивировать статически в течение 6 дней при 37 °C, 5% CO2.
  4. Средние изменения (День 15)
    1. Соберите органоиды в пробирки объемом 15 мл. Оставьте трубку в покое, пока все органоиды не осядут. Удалите надосадочную жидкость и добавьте свежую среду для дифференцировки (то же, что и на шаге 2.3.3, но с В27 + витамин А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно органоиды оседают на дне пробирки без центрифугирования. Тем не менее, небольшие органоиды, полученные из ИПСК пациента, могут не очень эффективно тонуть. В этом случае центрифугируйте пробирки при 120 × г в течение 3 мин при комнатной температуре, чтобы собрать органоиды.
    2. Перенесите ~10 органоидов на лунку в 6-луночный планшет. Культивировать статически в течение 15 дней при 37 °C, 5% CO2.
    3. Заменяйте средство каждые 5-7 дней до 30 дня.

3. Диссоциация церебральных органоидов для 2D культуры (День 30)

  1. Покрытие пластин поли-L-орнитином (PO)
    1. Приготовьте стоковый раствор ПО, растворив 10 мг ПО в 66,7 млН2Ои сделайте небольшие аликвоты для однократного применения. Храните их при температуре -20 °C до использования.
    2. Разбавьте стоковый раствор PO 1:5 сH2O и обмажьте планшеты для культуры разбавленным раствором. Инкубировать в течение ночи при 37 °C.
  2. Ламининовое покрытие
    1. Удалите PO и промойте лунки 3 x 5 мин PBS.
    2. Добавьте ламинин (1:1000 в PBS) и инкубируйте при 37 °C в течение 3 часов или в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный раствор ламинина составляет 1 мг/мл. Приготовьте небольшие аликвоты и храните при температуре -80 °C до тех пор, пока не понадобится.
  3. Диссоциация на отдельные нейроны
    1. Перед применением раствор диссоциации разморозьте при 4 °C в течение 1 часа.
    2. Перенесите органоиды в пробирку объемом 15 мл и оставьте пробирку в покое, пока все органоиды не осядут. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 5 мл PBS для промывки органоидов.
    3. После удаления PBS добавьте 1 мл ферментного раствора и аккуратно пипетку в 1–2 раза. Выдерживать при 37 °C в течение 5 минут; пипеткой несколько раз. При необходимости инкубируйте еще 2–3 мин. Еще раз пипетку до полного диссоциирования.
    4. Центрифуга при 200 × г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость, добавьте 1 мл дисперсионного раствора и пипетку.
    5. Слой изолирующего раствора снизу и центрифугирование при 200 × г в течение 5 минут.
    6. Добавьте 1 мл нейрональной среды (нейробазальная с 1% B27, 0,25% заменителя глютамина, 1% PS) и перемешайте. Пропустите суспензию через ситечко 70 мкм в пробирку объемом 50 мл.
    7. Посчитайте клетки. Затравочные клетки при 1 × 105 клеток/см2 на пластинах, покрытых ПО/ламинином. Заменяйте средство каждые 4-7 дней до 60 дня.

4. Забор клеток и органоидов для клеточного и молекулярного анализа

  1. Фиксация органоидов для иммунофлюоресценции (30-й день)
    1. Соберите органоиды (шаг 2.4.3) в микропробирки.
    2. Тщательно удалите среду, чтобы не отсасывать органоиды, и добавьте 1 мл PBS для промывания органоидов.
    3. Осторожно удалите PBS, чтобы не аспирировать органоиды, и добавьте 4% параформальдегид (PFA) для фиксации в течение 30 минут при комнатной температуре.
    4. Постирайте 3 раза с PBS.
    5. Хранить при температуре 4 °C до использования.
  2. Забор органоидов для ОТ-кПЦР (день 30)
    1. Перенесите органоиды (шаг 2.4.3) в микропробирки. Постирайте с PBS, как описано в шаге 4.1.2.
    2. Добавьте буфер для лизиса и мгновенно заморозьте в жидком азоте (LqN2). Хранить при температуре −80 °C до использования.
  3. Фиксация клеток для иммунофлюоресценции (60-й день)
    1. Удалите питательную среду и добавьте PBS для промывки клеток.
    2. Закрепить в 4% ПФА в течение 15 мин при комнатной температуре.
    3. Удалите PFA и добавьте PBS в промывочные камеры. Повторите этот шаг 3 раза.
    4. Хранить при температуре 4 °C до использования.

5. ОТ-кПЦР

  1. Извлеките общую РНК из органоидов в соответствии с инструкциями производителя набора.
  2. Синтезировать кДНК из 1 мкг общей РНК, полученной на Стадии 5.1 в соответствии с инструкциями производителя набора, в общем реакционном объеме 20 мкл.
  3. Проводят количественную ПЦР с использованием следующих праймеров: FOXG1_forward: CGCCAGATTTCCATGTGTGC; FOXG1_reverse: GTTCTCAAGGTCTGCGTCCA; ACTB_forward: TGAAGTGTGACGTGGACATC; ACTB_reverse: GGAGGAGCAATGATCTTGAT. Установите конечную концентрацию для каждой реакции следующим образом: 1x флуоресцентная мастер-смесь, 0,25 μМ прямой праймер, 0,25 μМ обратный праймер. Общий объем реакции составляет 15 мкл, в том числе 0,2 мкл кДНК из Стадии 5.2. Используйте следующие условия ПЦР: начальная денатурация при 95 °С в течение 1 мин; 40 циклов при температуре 95 °C в течение 15 с и при 60 °C в течение 30 с.
  4. Нормализуйте экспрессию FOXG1 в ACTB в качестве внутреннего контроля.

6. Иммунофлюоресцентное окрашивание

  1. Инкубировать органоиды (30-й день) в 10% сахарозе в течение 1 ч при 4 °C, затем 30% сахарозе в течение ≥3 ч при 4 °C.
  2. Органоиды смонтировать в закладную среду и подготовить криосекцию (10 мкм) с помощью криостата. Храните срезы на предметных стеклах при температуре −20 °C до использования.
  3. Удалите закладную среду с помощью промывки PBS (2 x 5 мин).
  4. Пермеабилизируйте в 0,3% PBST в течение 10 минут. Постирайте с помощью PBS.
  5. Заблокируйте в 10% нормальной козьей сыворотке 0,1% PBST на 1 ч. Инкубировать в течение ночи при 4 °C с первичными антителами: анти-FOXG1 (1:200), анти-TUBB3 (1:500-1:1,000). Постирайте 3 раза с PBS.
  6. Инкубировать с вторичным антителом (1:500) + Hoechst 33258 (1:500) в течение 1 ч. Постирайте 3 раза с PBS.
  7. Установите и наблюдайте под конфокальным микроскопом.

7. Гетероплазматический анализ

  1. Соберите ИПСК с помощью скребков для клеток и перенесите в микропробирки. Добавьте 0,5 мл PBS и центрифугируйте при 100 × г в течение 5 минут. Удалите надосадочную жидкость и перейдите к шагу 7.2.
  2. Извлеките общую ДНК в соответствии с инструкциями производителя набора.
  3. Установите конечную концентрацию для каждой ПЦР-реакции: 1x флуоресцентная мастер-смесь, 0,25 μМ прямой праймер, 0,25 μМ обратный праймер. Общий объем реакции составляет 15 мкл, в том числе 50 нг общей ДНК из Стадии 7.2. Используйте следующие условия ПЦР: начальная денатурация при 95 °С в течение 1 мин; 40 циклов при температуре 95 °C в течение 15 с и при 60 °C в течение 30 с. Последовательности праймеров следующие: MELASwt_foward: gtttgttaagatggcagagc; MELASwt_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; MELASmut_foward: gtttgttaagatggcagg; MELASmut_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagt; FBXO15_ вперед: gccaggaggtcttcgcta; FBXO15_ обратном направлении: aatgcacggctagggtcaaa.
  4. Используйте пороговые значения цикла для расчета числа копий митохондриальной ДНК (мутантный или дикий тип).
  5. Нормализовать до FBXO15 число копий ядерного гена.

8. Оценка размера и формы органоидов

  1. Получение изображений органоидов с помощью микроскопа в формате TIFF.
  2. Измеряйте размер и круглость с помощью программного обеспечения для анализа изображений с открытым исходным кодом. Откройте файлы TIFF, сохраненные на шаге 8.1, нажав «Файл» | Откройте и выберите файл. Выберите «Произвольное выделение» и обведите органоид. Затем нажмите «Анализировать» | Измерьте. Значения площади и круговости в полученных результатах были использованы для анализа на шаге 8.3.
  3. Проанализируйте данные, выполнив t-критерий, чтобы оценить, есть ли существенные различия по сравнению с контрольными линиями с помощью статистического программного обеспечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы сгенерировали органоиды мозга и провели двухмерные культуры нейронов с использованием относительно простого протокола с незначительными модификациями на основе Nakamura et al.9 (рис. 1). В предыдущем протоколе использовались V-образные 96-луночные планшеты, тогда как в этом исследовании мы использовали U-образные 96-луночные пластины с низким уровнем прикрепления, чтобы позволить клеткам естественным образом агрегироваться в центре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органоиды, индуцированные из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)/ИПСК представляют собой многообещающие модели заболеваний для редких трудноизлечимых заболеваний, в то время как генерация органоидов мозга обычно требует длительных периодов культивирования внесколько месяцев и использования дорогостоящего оборудования, такого как сконструированный контейнер, который непрерывно перемешивает питательную среду и поддерживает стабильные условия для долгос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ИПСК 414C2 были получены из RIKEN BRC. Финансовая поддержка была предоставлена JSPS KAKENHI (24H00648 для M.F., 23K08971 для C.S.) и программой AMED Translational Research Network Program (25yf0126001j002 для M.F.). Эта работа была поддержана стипендией Германской службы академических обменов (DAAD) в Ф.Б.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10-сантиметровая чаша для клеточной культурыКорнинг353003
6-скважинная пластина с ультранизкой поверхностью крепленияКорнинг3471
70 μ Сито M-ячейкиКорнинг352350
АккутазаNacalai Tesque12679-54ферменты, используемые для диссоциации iPSC
Дополнение B27Thermofischer scientific17504001
Добавка B27 без витамина AThermofischer scientific12587010
&бета;-меркаптоэтанол (2-ME)SigmaM3148Выбрасывайте согласно правилам учреждения.
Клеточная культура 6 колодца, многопластиннаяКорнинг353046
Наконечник сохранения ячейкиBMBio ECOBMT-200WШирокоствольный кончик пипетки
Скребки для ячейкиSUMITOMO BAKELITECO., LTD.MS-93100
Конфокальный микроскопZeissLSM710
КриостатLeicaCM3050
Culture Mouse Laminin 1R& D3400-010-02используется для покрытия пластин для двумерных культур диссоциированных нейронов
DMEM/F12FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.042-30795
Флуоресцентная монтажная средаDAKOS302380-2Монтажная среда
Антитела FOXG1Abcamab196868
ГлутамаксThermofischer scientific35050061
Козла против мышей IgG (H+L) — высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor Plus 488Thermofischer scientificA32723
Козий антикроликовый антител IgG (H+L) — высокоадсорбируемое вторичное антитело, Alexa Fluor Plus 555Thermofischer scientificA32732
Хепаран Сульфат (HS)SigmaH7640
Набор высокой ёмкости РНК-кДНКThermofischer scientific4387406используется для синтеза кДНК из РНК
Hoechst 33258Thermofischer scientificH3569
ImageJВерсия 1.52aиспользуется для измерения размера и циркулярности органоидов
Шелк iMatrix-511Takara Bio Inc.892021покрытие пластин для культуры iPSC
ИнсулинFUJIFILM Wako Pure Chermical Co.  090-06481
IWP2Tocris Bioscience3533
Keyence BZ-X810КейенсBZ-X810используется для съёмки изображений для рисунка 3A
LSM710Carl Zeiss AGКонфокальный микроскоп
LSM980Carl Zeiss AGКонфокальный микроскоп
LUNA Universal qPCR Master MixNew England BiolabsM3003
МатригельКорнинг354277
Дополнение N2Thermofischer scientific17502001
Нейробазальная средаThermofischer scientific21103049
Решение для диссоциации нейронов FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.291-78001
незаменительные аминокислоты (NEAA)Nacalai Tesque06344-56
Обычная козья сывороткаJackson ImmunoResearch Inc. 005000121
Nunclon Sphera 96-колодца, обработанная Nunclon Sphera, микропластина с U-образным дномThermofischer scientific174929
Параформальдегид (PFA)Nacalai Tesque09154-85Выбрасывайте согласно правилам учреждения.
PBSNacalai Tesque14249-24
PBSNacalai Tesque27575-31
Пенициллин/стрептомицин (PS)Nacalai Tesque26253-84
Поли-L-орнитин (PO)SigmaP3655
Полиоксиэтилен(10) октилфенил-эфир (тритон)FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.168-11805
PRISM GraphPadВерсия 9.5.0
QIAamp ДНК-мини-комплект  QIAGEN51304используется для извлечения полной ДНК
Мини-комплект RNeasyQIAGEN74104используется для извлечения полной РНК
SB-431542Cayman Chemical13031
Стекла-слайдыМАЦУНАМИCRE-05
StemFit AK02NTakara Bio Inc.AK02Nсреда, используемая для выращивания недифференцированных iPSC и от дифференциации от Дня 0 до Дня 6
СахарозаFUJIFILM Wako Pure Chermical Co.196-00015
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek Japan Co., Ltd.4583Среда криоконсервации
Антитела к TUBB3PromegaG712A
Y27632FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.030-24021Ингибитор ROCK
ДЗЕНCarl Zeiss AG2.3SP1 (чёрное издание)программное обеспечение для анализа сделанных изображений  с конфокальным микроскопом (LSM710)
ДЗЕНCarl Zeiss AG2.6 (синее издание)программное обеспечение для анализа сделанных изображений  с помощью конфокального микроскопа (LSM980)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sproule, D. M., Kaufmann, P. Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: basic concepts, clinical phenotype, and therapeutic management of MELAS syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1142, 133-158 (2008).
  2. Kirino, Y., Suzuki, T. Human mitochondrial diseases associated with tRNA wobble modification deficiency. RNA Biol. 2 (2), 41-44 (2005).
  3. Shaffer, S. W., et al. Role of taurine in the pathologies of MELAS and MERRF. Amino Acids. 46, 47-56 (2014).
  4. Shaffer, S. W., Kim, H. W. Effects and mechanisms of taurine as a therapeutic agent. Biomol Ther. 26, 225-241 (2018).
  5. Rikimaru, M., et al. Taurine ameliorates impaired mitochondrial function and prevents stroke-like episodes in patients with MELAS. Intern Med. 51 (24), 3351-3357 (2012).
  6. Ohsawa, Y., et al. Taurine supplementation for prevention of stroke-like episodes in MELAS: a multicentre, open-label, 52-week phase III trial. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 90 (5), 529-536 (2019).
  7. Tolle, I., Tiranti, V., Prigione, A. Modeling mitochondrial DNA diseases: from base editing to pluripotent stem-cell-derived organoids. EMBO Rep. 24 (4), e55678(2023).
  8. Fujikura, J., et al. Induced pluripotent stem cells generated from diabetic patients with mitochondrial DNA A3243G mutation. Diabetologia. 55 (6), 1689-1698 (2012).
  9. Nakamura, M., et al. Pathological progression induced by the frontotemporal dementia-associated R406W tau mutation in patient-derived iPSCs. Stem Cell Rep. 13 (4), 684-699 (2019).
  10. Pagliaro, A., Artegiani, B., Hendriks, D. Emerging approaches to enhance human brain organoid physiology. Trends Cell Biol. 35 (6), 483-499 (2025).
  11. Kodaira, M., et al. Impaired respiratory function in MELAS-induced pluripotent stem cells with high heteroplasmy levels. FEBS Open Bio. 5, 219-225 (2015).
  12. Homma, K., et al. Taurine rescues mitochondria-related metabolic impairments in the patient-derived induced pluripotent stem cells and epithelial-mesenchymal transition in the retinal pigment epithelium. Redox Biol. 41, 101921(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MELAS

Похожие статьи