Методическая статья

Подготовка экономичных и универсальных компенсационных бусин, совместимых с многовидовыми антителами

118 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70114

⸱

17 апреля 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, 2Center for gene and immunotherapy, The Second Qilu Hospital of Shandong University, 3Department of Radiology, The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University & Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, 4Department of Urology, The second hospital of Tianjin Medical University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает экономичный метод подготовки мульти-совместимых компенсирующих шариков для компенсации флуоресценции в потоковой цитометрии с использованием рекомбинантных микросфер из полистирола, связанных с белками A/G/L.

Аннотация

Этот протокол описывает экономичный и воспроизводимый метод подготовки многовидовых компенсирующих шариков для компенсации флуоресценции в многоцветной потоковой цитометрии. Здесь рекомбинантный иммуноглобулин-связывающий белок A/G/L (Белок A/G/L), содержащий несколько иммуноглобулин-связывающих доменов, экспрессировался в Escherichia coli (E. coli), очищен с помощью никелевой аффинной хроматографии и ковалентно связан с карбоксилированными полистироловыми микросферами с помощью химии EDC/NHS. Полученные шарики связываются с антителами различных видов и подклассов, создавая сильные и отчетливые флуоресцентные сигналы, подходящие для установки компенсации. Эти результаты дают практические рекомендации по выбору диаметра шарика и белковой нагрузки для достижения флуоресцентной интенсивности, соответствующей различным требованиям к компенсации. Успешное выполнение протокола подтверждается эффективной очисткой белка и чётким, высокоинтенсивным пиком флуоресценции сопряжённых шариков по сравнению с контрольными шариками при анализе потоковой цитометрии. Этот простой и масштабируемый подход позволяет регулярно готовить стабильные и универсальные компенсационные шарики в стандартных лабораториях, снижая затраты и повышая гибкость для применения проточной цитометрии.

Введение

Потоковая цитометрия стала незаменимым инструментом в иммунологии, клеточной биологии и клинических исследованиях для многопараметрического анализа популяцийклеток 1,2,3. Критической проблемой в традиционной многоцветной цитометрии потоков является перелив флуоресценции, при котором эмиссионный спектр фторхрома пересекается с несколькими детекторными каналами, что приводит к загрязнению сигнала и ошибочнойинтерпретации 4,5. Поэтому правильная компенсация необходима для точной интерпретации данных.

Традиционно компенсационные контроли готовятся с использованием одноцветных окрашенных клеток. Однако ограниченное количество клеток, вариативная экспрессия антигенов и дифференцированное связывание антител с клетками представляютвызовы 6. В результате синтетические шарики, модифицированные для связывания антител, конъюгированных с фторхромом, появились как практическаяальтернатива 7,8. Бусины обладают преимуществами стабильной способности связывания, высокой интенсивностью флуоресценции и независимости от уровней экспрессии клеточногоантигена 9. По сравнению с одновидовыми или Fc-ограниченными реагентами захвата, включение нескольких иммуноглобулин-связывающих доменов (белки A, G и L) расширяет покрытие видов и совместимость форматов антител, позволяя одной бусинке принимать различные антитела, конъюгированные фторохромом.

Среди шариков, используемых для компенсации, связывание иммуноглобулин-связывающих белков, таких как белок A, Protein G и Protein L, обеспечивает широкую совместимость с изотипами антител разных видов. Белки A и G связываются с областью Fc многих подклассов IgG, тогда как белок L связывается с κ-лёгкими цепями иммуноглобулинов и тем самым расширяет способность связываться с Fab-фрагментами и одноцепнымиантителами 10,11.

Хотя коммерческие компенсационные бусины доступны, их относительно высокая стоимость может быть слишком высокой для лабораторий с ограниченным бюджетом, что ограничивает их широкоеприменение 3. Учитывая эти трудности, возникает необходимость в гибких, настраиваемых платформах для бусин, позволяющих исследователям определять размер шариков, домены связывания антител и типы антител, используемые для контроля компенсации. Цель этого протокола — предоставить простой, экономичный и воспроизводимый метод подготовки многовидовых компенсирующих шариков для многоцветной потоковой цитометрии. Этот протокол описывает проектирование, экспрессию и очистку белка рекомбинантного слияния, содержащего несколько доменов, связывающих иммуноглобулин, из белков A, G и L, после чего его ковалентная конъюгация с карбоксильно-модифицированными полистироловыми шариками определённого диаметра.

Протокол описывает молекулярную конструкцию фьюжн-белка, его экспрессию и очистку в E. coli , а также подготовку реагентов на основе бусины, совместимых с несколькими антителами, конъюгированными с фторхромом. Этот протокол предназначен для лабораторий, выполняющих многоцветную проточную цитометрию в различных исследовательских условиях, включая иммунологию, онкологию и трансляционные исследования, особенно там, где требуется снижение затрат, совместимость между видами и гибкий контроль компенсации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все буферы и реагенты свежим образом, как указано в Таблице 1. Подготовьте решения EDC и NHS непосредственно перед использованием; Не храните их. Для всех остальных буферов (Лизис, Биндинг, Мойка, Элюция, MES, PBS, Tris) заранее подготовьте запасные растворы и храните их при 4 °C. Уравновесьте хранящиеся буферы до соответствующей реакционной температуры (комнатная температура или 4 °C) перед использованием. Убедитесь, что буферы FACS и буферы хранения подготовлены свежими или хранятся при температуре 4 °C.

1. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка A/G/L

  1. Экспрессия рекомбинантного белка A/G/L
    1. Преобразование плазмиды pET28-Protein A/G/L в клетки, способные к E. coli BL21(DE3), используя стандартный протокол теплового удара.
    2. Пластинируйте трансформированные клетки на ЛБ-агаре, содержащем 50 мкг·мл-1 канамицина, и инкубировать их ночью при 37 °C.
    3. Инокулизируйте одну колонию в 5–10 мл бульона LB, содержащего канамицин (50 мкг·мл-1), и выселять ночью при 37 °C с встряхиванием при 200 × г.
    4. Переносите ночную культуру в 200 мл LB с канамицином (конечная концентрация 50 мкг·мл-1) при разбавлении 1:100.
    5. Выращивайте культуру при 37 °C до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нМ (OD600) не достигнет 0,6–0,8.
    6. Индуцировать экспрессию белков путём добавления изопропила β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) к конечной концентрации 0,5 мМ и инкубировать при 28 °C в течение 12–16 часов.
    7. Собирайте клетки центрифугой при 4 °C, 4000 × г в течение 10 минут.
    8. Отбросьте супернатант и снова суспензуйте клеточную гранулу в буфере лизис. Действуйте немедленно или храните гранулы при -80 °C.
      Точка паузы: Клеточные гранулы могут храниться при -80 °C в течение нескольких недель перед лизисом.
  2. Лизис клетки
    1. Повторно суспензировать бактериальную гранулу в 10 мл лизисного буфера на грамм влажной массы клеток.
    2. Лизируйте ячейки с помощью гомогенизатора высокого давления, установленного на 1000 бар, пропуская суспензию через 2–3 цикла, пока раствор не станет менее вязким и полупрозрачным.
      Примечание: Альтернативно, разрыв ячеек может осуществляться с помощью соникации на льду в режиме импульса (5 с включено / 10 с выключено) в течение 8–12 циклов, чтобы избежать перегрева. Обеспечьте полный лизис, изучая небольшой аликвот под микроскопом.
    3. Центрифугуйте лизат при 12000 × г в течение 30 минут при 4 °C.
    4. Соберите супернатант как растворимую белковую фракцию для очистки.
  3. Очищение аффинности Ni-NTA
    1. Уравновешенность столбцов и загрузка выборки
      1. Уравновесить колонку Ni-NTA с 10 столбцовыми объёмами (CV) буфера связывания, содержащим 10 мМ имидазола.
      2. Фильтруйте очищенный лизат через фильтр 0,45 мкм, добавьте имидазол до конечной концентрации 10 мМ и загрузите его на колонку при 0,5 CV·min-1.
      3. Собирайте проточную долю для контроля эффективности связывания.
    2. Стирка
      1. Промыйте колонну 10 CV буфера для связки и буфера для промывки с 20 мМ имидазолом при расходе 1 CV·min-1.
    3. Элюция
      1. Элюируйте целевой белок с буфером элюции при расходе 1 CV·min-1.
      2. Собирайте фракции и контролируйте A280 для выявления белоксодержащих фракций.
    4. Обмен буферов и хранение белков
      1. Переместить очищенный раствор белка в центробежную ультрафильтрационную трубку с отсечением молекулярной массы (MWCO) 50 кДа.
      2. Центрифуга при 3 500 × г в течение 15–20 минут при 4 °C до достижения желаемой концентрации.
      3. Отбросьте проток и добавьте равный объём буфера PBS (pH 7,4) к ретентату для обмена буфером.
      4. Повторите центрифугирование и замену PBS 2–3 раза, чтобы полностью заменить исходный буфер на PBS.
      5. После последнего этапа концентрации соберите ретентат и измерьте концентрацию белка.
      6. Проверьте элюированные дроби с помощью SDS-PAGE; ожидаемая молекулярная масса белка A/G/L составляет примерно 90 кДа.
      7. Аликвотируйте очищенный белок и храните при -80 °C до дальнейшего использования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить на этом этапе. Очищенный белок A/G/L может храниться при -80 °C для последующего сопряжения с шариками. После концентрации было получено примерно 10 мг очищенного белка A/G/L из 200 мл бактериальной культуры с конечной концентрацией 2–5 мг·мл⁻1.

2. Сопряжить шарики с белком A/G/L

  1. Предварительная промывка бусины
    1. Вихрь с бусинкой на максимальной скорости 20–30 секунд при комнатной температуре (20–25 °C) для равномерного повторного суспензия. Перенесите 0,2 мл 8 мкм шарика (5 мг) в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
    2. Гранулы с помощью центрифуга, 5000 × г в течение 3 минут при комнатной температуре.
    3. Аккуратно аспирируйте и выбросьте супернатант, не нарушая гранулу.
    4. Добавьте 1 мл 0,1 м буфера MES, аккуратно подвесьте с помощью пипетирования или мягкого вихря, снова центрифугуйте 5000 × г на 3 минуты при комнатной температуре и удалите супернатант. Повторите эту промывку один раз (всего два MES мойки).
  2. Активация в EDC/NHS
    ВНИМАНИЕ: EDC и NHS являются раздражителями, и с ними следует обращаться с соответствующими средствами индивидуальной защиты в вытяжке.
    1. Суспензировать шарики в буфере 0,5 мл МЭС, затем последовательно добавить 50 мкл 50 мг·мл-1 NHS и 100 мкл 50 мг·мл-1 EDC.
      Примечание: решения EDC и NHS должны быть подготовлены свежими непосредственно перед использованием.
    2. Вихрь и инкубация на вращающем шейкере при комнатной температуре в течение 30 минут до активации.
  3. Удалите активационные реагенты и промыйте
    1. Гранулы: 5000 × г, 3 минуты, при комнатной температуре. Аккуратно удалите супернатант.
    2. Добавьте 1 мл буфера PBS, аккуратно суспенгируйте, центрифугуйте (5000 × г, 3 минуты, при комнатной температуре) и удалите супернатант. Проведите одну промывку PBS для удаления активационных реагентов.
  4. Белковая связь
    1. Повторно суспензировать активированную гранулу в 0,4–0,5 мл PBS (целевой объём реакции 0,5–0,6 мл). Держите объём низким, чтобы повысить эффективную концентрацию белка.
    2. Добавьте 100 мкг белка A/G/L. Аккуратно перемешайте.
    3. Инкубировать реакцию на катящемся шейкере при комнатной температуре в течение 2 часов для быстрого соединения, или при 4 °C ночью. Сохраняйте мягкое прокатывание, чтобы предотвратить оседание бусин.
  5. Реакция закалки/прекращения
    1. Гранулы (5000 × г, 3 мин) и удалите супернатант.
    2. Добавьте 1 мл 0,1 M Tris (pH = 7,4), чтобы закалить оставшиеся эфиры NHS. Подвесьте и инкубуйте на движущемся шейкере 30 минут при комнатной температуре.
    3. Шарики гранул и промывайте с помощью 1 мл PBS в той же микроцентрифужной трубке на 1,5 мл. Снова центрифугировать (5000 × г, 3 мин) и отбросить супернатант. Затем подвесите шарики с буфером хранения 0,5 мл.
      Точка паузы: протокол можно приостановить на этом этапе. Бусины с повторной суспензией могут храниться при 4 °C.
  6. Смешивайте и храните
    1. Считая сопряжённые и неспряжённые бусины. Смешайте сопряжённые и неконъюгированные шарики в соотношении 25%–75% в новой микроцентрифуге на 1,5 мл.
    2. Смесь с шариками подвешивают в 1 мл буфера хранения (PBS содержит 1% BSA и 0,05% антимикробного консерванта).
    3. Перенесите подвеску в маркированную трубку и храните при 4 °C. Защита от света не требуется. Аккуратно подвесите перед использованием, чтобы обеспечить равномерное распределение бусин. При таких условиях бусины остаются стабильными как минимум 6 месяцев.

3. Представитель QC

  1. Инкубировать 10 мкл сопряжённых шариков с 1 мкл флуоресцентных антител в буфере FACS 100 мкл в течение 15–30 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В каждой трубке должно быть только одно флуоресцентное антитело.
  2. Промывайте шарики с 1 мл PBS, повторно подвешивайте в 300–500 мкл PBS и работайте на потоковом цитометре.
  3. Настройте канал обнаружения в соответствии с флюорофором, конъюгированным с антителом (например, лазер 488 нМ с детектором FITC для антител, конъюгированных с FITC). В качестве отправной точки может использоваться репрезентативный диапазон напряжений фотоумножителя (PMT) от 0 до 200 В и корректироваться в зависимости от работы прибора. Соберите не менее 10 000 событий на один образец.
  4. Ворота на бусинах от FSC/SSC. Положительные шарики должны показывать чёткий одиночный пик с высоким MFI в канале фторофора; Отрицательный контроль должен показывать только фон.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рекомбинантный синтез белка A/G/L состоит из 816 аминокислот с рассчитанной молекулярной массой 90,5 кДа (Дополнительный файл 1). Этот синтезирующий белок сохраняет пять доменов B-связывающих IgG-связывающих Белка A, два домена IgG-связывающих Белка G и пять доменов B-доменов с лёгким цепочным связыванием κ из белка L, при этом домен связывания альбумина был удалён (Рисунок 1A, Таблица дополнения 1). В C-конец был добавлен о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает практичный и эффективный рабочий процесс по приготовлению флуоресцентных компенсационных шариков на основе рекомбинантного белка A/G/L. Процедура включает экспрессию бактерий, очистку аффинности Ni-NTA и ковалентное соединение очищенного белка с карбоксил-модифицированными полистироловыми микросферами с использованием химии EDC/NHS. Полученные шарики способны связывать антитела различных видов и подклассов, предоставляя универсальный и экономичный инструмент для к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что у них нет конфликтов интересов и что им нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Научно-исследовательской программой Тяньцзиньской образовательной комиссии (2021KJ224).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AF647 Rat Ig2aBioLegend141711
APC Mouse IgG1BioLegend353311
Компетентные ячейки BL21(DE3)СангонB528414
BSASolarbioA8010
EDCТермо Фишер22980CAS: 1892-57-5
FITC Армянский хомяк IgGBioLegend400905
ИмидазолСигма-ОлдричI202CAS: 288-32-4
IPTGGoldBioI2481CCAS: 367-93-1
Kanamycin СангонA600286CAS: 8063-07-8
KClАладдинP112134CAS: 7447-40-7
KH2PO4АладдинP434010CAS: 7778-77-0
MESСигма-ОлдричM3671CAS: 145224-94-8
Na2HPO4АладдинS274390CAS: 7558-79-4 
NaClАладдинC111549CAS: 7647-14-5
NHSТермо Фишер24500CAS: 6066-82-6
Ni NTA Beads 6FFSmart-LifesciencesSA005005
PE мышь IgG2aBioLegend362603
ProClean 300BeyotimeST853
Tris Сигма-Олдрич252859CAS: 77-86-1 
ТриптонОксоидLP0042
Ультрацентробежный фильтр, 50 кДа MWCOМиллипорUFC9050
Однородные микросферы карбоксилного полистиролаTomicro Biotech10 мл, 25 мг/млШанхай, Китай
Дрожжевый экстрактОксоидLP0021

Ссылки

  1. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2005).
  2. Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
  3. Bhowmick, D., Lowe, S. K., Ratliff, M. L. Side-by-side comparison of compensation beads used in polychromatic flow cytometry. Immunohorizons. 7 (12), 819-833 (2023).
  4. Szaloki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 982-985 (2015).
  5. Tang, H., et al. Economical and efficient protocol for isolating and culturing bone marrow-derived dendritic cells from mice. J Vis Exp. (185), e63125(2022).
  6. Sun, J., Kroeger, J. L., Markowitz, J. Introduction to multiparametric flow cytometry and analysis of high-dimensional data. Methods Mol Biol. 2194, 239-253 (2021).
  7. Blazer, L. L., Roman, D. L., Muxlow, M. R., Neubig, R. R. Use of flow cytometric methods to quantify protein-protein interactions. Curr Protoc Cytom. 53, 13.11-13.15 (2010).
  8. Zheng, Z., Chinnasamy, N., Morgan, R. A. Protein l: A novel reagent for the detection of chimeric antigen receptor (car) expression by flow cytometry. J Transl Med. 10, 29(2012).
  9. Chevrier, S., et al. Compensation of signal spillover in suspension and imaging mass cytometry. Cell Syst. 6 (5), 612-620.e5 (2018).
  10. Patella, V., Casolaro, V., Bjorck, L., Marone, G. Protein l. A bacterial ig-binding protein that activates human basophils and mast cells. J Immunol. 145 (9), 3054-3061 (1990).
  11. Eliasson, M., et al. Chimeric igg-binding receptors engineered from staphylococcal protein a and streptococcal protein g. J Biol Chem. 263 (9), 4323-4327 (1988).
  12. Hattori, T., et al. Multiplex bead binding assays using off-the-shelf components and common flow cytometers. J Immunol Methods. 490, 112952(2021).
  13. Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques. , Academic press. (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

A G LEDC NHS

Похожие статьи