Этот протокол описывает экономичный метод подготовки мульти-совместимых компенсирующих шариков для компенсации флуоресценции в потоковой цитометрии с использованием рекомбинантных микросфер из полистирола, связанных с белками A/G/L.
Методическая статья
Этот протокол описывает экономичный метод подготовки мульти-совместимых компенсирующих шариков для компенсации флуоресценции в потоковой цитометрии с использованием рекомбинантных микросфер из полистирола, связанных с белками A/G/L.
Этот протокол описывает экономичный и воспроизводимый метод подготовки многовидовых компенсирующих шариков для компенсации флуоресценции в многоцветной потоковой цитометрии. Здесь рекомбинантный иммуноглобулин-связывающий белок A/G/L (Белок A/G/L), содержащий несколько иммуноглобулин-связывающих доменов, экспрессировался в Escherichia coli (E. coli), очищен с помощью никелевой аффинной хроматографии и ковалентно связан с карбоксилированными полистироловыми микросферами с помощью химии EDC/NHS. Полученные шарики связываются с антителами различных видов и подклассов, создавая сильные и отчетливые флуоресцентные сигналы, подходящие для установки компенсации. Эти результаты дают практические рекомендации по выбору диаметра шарика и белковой нагрузки для достижения флуоресцентной интенсивности, соответствующей различным требованиям к компенсации. Успешное выполнение протокола подтверждается эффективной очисткой белка и чётким, высокоинтенсивным пиком флуоресценции сопряжённых шариков по сравнению с контрольными шариками при анализе потоковой цитометрии. Этот простой и масштабируемый подход позволяет регулярно готовить стабильные и универсальные компенсационные шарики в стандартных лабораториях, снижая затраты и повышая гибкость для применения проточной цитометрии.
Потоковая цитометрия стала незаменимым инструментом в иммунологии, клеточной биологии и клинических исследованиях для многопараметрического анализа популяцийклеток 1,2,3. Критической проблемой в традиционной многоцветной цитометрии потоков является перелив флуоресценции, при котором эмиссионный спектр фторхрома пересекается с несколькими детекторными каналами, что приводит к загрязнению сигнала и ошибочнойинтерпретации 4,5. Поэтому правильная компенсация необходима для точной интерпре....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все буферы и реагенты свежим образом, как указано в Таблице 1. Подготовьте решения EDC и NHS непосредственно перед использованием; Не храните их. Для всех остальных буферов (Лизис, Биндинг, Мойка, Элюция, MES, PBS, Tris) заранее подготовьте запасные растворы и храните их при 4 °C. Уравновесьте хранящиеся буферы до соответствующей реакционной температуры (комнатная температура или 4 °C) перед использованием. Убедитесь, что буферы FACS и буферы хранения подготовлены свежими или хранятся при температуре 4 °C.
1. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка A/G/L
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Рекомбинантный синтез белка A/G/L состоит из 816 аминокислот с рассчитанной молекулярной массой 90,5 кДа (Дополнительный файл 1). Этот синтезирующий белок сохраняет пять доменов B-связывающих IgG-связывающих Белка A, два домена IgG-связывающих Белка G и пять доменов B-доменов с лёгким цепочным связыванием κ из белка L, при этом домен связывания альбумина был удалён (Рисунок 1A, Таблица дополнения 1). В C-конец был добавлен о.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Этот протокол описывает практичный и эффективный рабочий процесс по приготовлению флуоресцентных компенсационных шариков на основе рекомбинантного белка A/G/L. Процедура включает экспрессию бактерий, очистку аффинности Ni-NTA и ковалентное соединение очищенного белка с карбоксил-модифицированными полистироловыми микросферами с использованием химии EDC/NHS. Полученные шарики способны связывать антитела различных видов и подклассов, предоставляя универсальный и экономичный инструмент для к.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все авторы заявляют, что у них нет конфликтов интересов и что им нечего раскрывать.
Эта работа была поддержана Научно-исследовательской программой Тяньцзиньской образовательной комиссии (2021KJ224).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| AF647 Rat Ig2a | BioLegend | 141711 | |
| APC Mouse IgG1 | BioLegend | 353311 | |
| Компетентные ячейки BL21(DE3) | Сангон | B528414 | |
| BSA | Solarbio | A8010 | |
| EDC | Термо Фишер | 22980 | CAS: 1892-57-5 |
| FITC Армянский хомяк IgG | BioLegend | 400905 | |
| Имидазол | Сигма-Олдрич | I202 | CAS: 288-32-4 |
| IPTG | GoldBio | I2481C | CAS: 367-93-1 |
| Kanamycin | Сангон | A600286 | CAS: 8063-07-8 |
| KCl | Аладдин | P112134 | CAS: 7447-40-7 |
| KH2PO4 | Аладдин | P434010 | CAS: 7778-77-0 |
| MES | Сигма-Олдрич | M3671 | CAS: 145224-94-8 |
| Na2HPO4 | Аладдин | S274390 | CAS: 7558-79-4 |
| NaCl | Аладдин | C111549 | CAS: 7647-14-5 |
| NHS | Термо Фишер | 24500 | CAS: 6066-82-6 |
| Ni NTA Beads 6FF | Smart-Lifesciences | SA005005 | |
| PE мышь IgG2a | BioLegend | 362603 | |
| ProClean 300 | Beyotime | ST853 | |
| Tris | Сигма-Олдрич | 252859 | CAS: 77-86-1 |
| Триптон | Оксоид | LP0042 | |
| Ультрацентробежный фильтр, 50 кДа MWCO | Миллипор | UFC9050 | |
| Однородные микросферы карбоксилного полистирола | Tomicro Biotech | 10 мл, 25 мг/мл | Шанхай, Китай |
| Дрожжевый экстракт | Оксоид | LP0021 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение