Генерация костного мозга мышей Производные дендритных клеток для использования в 2-фотонных изображений

Краткое содержание

Антиген презентации во вторичных лимфоидных органах по дендритных клеток имеет решающее значение для инициирования Т-клеток опосредованный адаптивный иммунный ответ. Здесь мы показываем, культуре костного мозга производных мышиных дендритных клеток, активации, и маркировки для 2-фотонного изображения.

Аннотация

Существует несколько методов для подготовки мышиных дендритных клеток можно найти в литературе. Здесь мы представляем метод, который производит более 85% CD11c высокой дендритных клеток в культуре, дома дренаж лимфатических узлов после подкожного введения и настоящего антигена антиген специфический Т-клеток (см. видео). Кроме того, мы используем инструменты Эссен Incucyte отслеживать созревание дендритных камеру, где, в день 10, морфология культивируемых клеток характерна для зрелых дендритных клеток и <85% клеток CD11chigh. Изучение презентации антигена в периферических лимфатических узлов на 2-фотонных изображений показал, что Существуют три различных этапа дендритных клеток и Т-клеточного взаимодействия ^{1, 2.} Этап I состоит из краткого серийный контактов между высоко подвижных антиген специфический Т-клеток и антигена проведения дендритные клетки ^{1, 2.} Второй этап характеризуется длительным контактам между антиген-специфических Т-клеток и антигена подшипников дендритные клетки ^{1, 2.} Наконец, фаза III характеризуется Т-клеток, отходящие от дендритных клеток, восстановление подвижности и начинают делить ^{1, 2.} Это один из примеров типа антиген-специфические взаимодействия, которые могут быть проанализированы двухфотонного изображения антиген-загружалась ячейки трекер красителя меченных дендритные клетки.

Протокол

1) Снимите оба бедра кости от одной мыши

1. Используйте рассечение ножницами, чтобы отрезать мышц и подвергать бедренной кости выше и ниже суставов (коленных и тазобедренных). Возьмитесь центр бедренной кости с рассечением пинцет и голову выше и ниже суставов уйти, так как большая часть эпифиза нетронутыми, насколько возможно.
2. Очистите сила мышц, возможна с помощью небольших ножниц рассечение. Передача бедра в блюдо RPMI.
3. Все процедуры должны выполняться в капюшоне с этого момента, используя только стерильные среды, инструменты, наконечники и культуры блюд.

2) Стерилизовать бедра кости:

1. В капот, передача костей RPMI в небольшое блюдо культуры заполнены на 70% этанола на льду.
2. Разрешить кости, чтобы впитать в этаноле в течение 5 минут на льду.

3) Сбор костного мозга в стерильных условиях:

1. Передача кости небольшое блюдо культуры, содержащие стерильно фильтруют Первичная культура DC СМИ.
2. С стерильный пинцет, удерживая кость над блюдом отказать или трубки, и стерильными ножницами, разрезать каждый epiphesis (концы кости) выключен. Сократить должны подвергать костного мозга которая ярко-красным в центре кости.
3. С стерильный шприц (26-28 иглы), сосать около 100-200 мл стерильного средства массовой информации.
4. Держите кости с стерильный пинцет более свежие блюда из стерильных средств массовой информации и вставить иглу в одну сторону кости. Поместите кончик иглы в верхней части кости и медленно мыть кости с стерильных средств массовой информации. Если вы находитесь в центре кости, игла должна слайд легко.
5. Костного мозга вымывает, либо в мелкие кусочки или как единое целое. Следует вспыхнул из кости и в блюдо стерильных средств массовой информации.
6. Повторите этот шаг, по мере необходимости, чтобы полностью вымыть мозг из костей.
7. Когда кости чист, то он будет белым и прозрачным.
8. Повторите эту процедуру с другой кости бедра. Отменить каждого бедренной кости, когда он будет чистым.

4) Снова приостановить и спин вниз клетки костного мозга:

1. Передача клетки стерильную пробирку сокола.
2. Если мозг не тронута, очень осторожно пипеткой средств массовой информации вверх и вниз в тарелку, чтобы разбить мозга в суспензии отдельных клеток. Это может занять несколько минут и следует проводить медленно, чтобы избежать убийства клетки одной только силой.
3. Центрифуга клетки, как и любой другой клетки млекопитающих.

5) лизиса клеток:

1. Снимите трубку из центрифуги после спина делается и залить СМИ выключен (перелить) в небольших отходов (50 мл сокола трубки) в капюшоне.
2. Ресуспендируют гранул, аккуратно стряхивая нижней части трубы.
3. Использование стерильной фильтрованной воды и 10x или 10x DPBS PBS, осуществляют лизис воды для удаления красных кровяных телец (эритроцитов) с использованием следующих объемах:
   • 900 мл стерильной фильтрованной воды
   • 100 мл 10х или 10х DPBS PBS
4. Добавить 100 мл 10х PBS 5-10 секунд после добавления воды. Очень важно сделать это немедленно, так что только эритроциты лизируются. Это хорошая идея, чтобы иметь как пипетки заполнены и готовы.
5. Добавьте 5 мл - 10 мл стерильного DC СМИ основной.

6) Считайте Клетки:

1. В капот, смешать с 6 по 11 мл клеток костного мозга, осторожно вращая трубку с небольшой инверсии, 45 наклона степени (не так, чтобы средства массовой информации касается верхней части трубки)
2. Удалить 10 мл СМИ в стерильную пробирку для подсчета.
3. Re капитализации клеток и центрифуга снова.

7) клетки Дендритные Покрытие:

1. Клетки должны быть покрыты при плотности 1 х 106/mL.
2. Удалить клетки из центрифуги, переливать СМИ и вновь приостановить клеток в соответствующее количество первичных СМИ постоянного тока для металлизации.
3. Место в культуре ткани инкубатора.

8) Уход культуры и созревание:

Всегда проверяйте культур, прежде чем добавлять больше средств массовой информации или использования в каких-либо экспериментов. Проверьте общее состояние здоровья клеток и искать потенциальных загрязнений.

ДЕНЬ 0: дендритные клетки покрытием.

ДЕНЬ 3: Удаление 75% от средств массовой информации и неправительственные adherant клеток и добавить обратно Первичная DC СМИ.

День 6: После Первоначальное покрытие Cell: Re пластины клетки, используя следующую процедуру:

1. Удалить средства массовой информации, которое должно содержать некоторые не adherant контроллеры домена в этой точке, и место в стерильные 50 мл трубки сокол, в результате чего пластины слегка влажной (вы не хотите, прилипшие клетки высохнуть)
2. Добавьте 3 мМ ЭДТА в PBS в каждую тарелку и позволить сидеть в течение 5 минут.
3. Держите пластины на 45 градусов и осторожно пипеткой средств массовой информации вверх и вниз от нижней части пластины, чтобы аккуратно выбить без adherant клеток.
4. ЭДТА / PBS должна стать толще указывает клетки собирают со днапластины.
5. После нескольких минут этого, сотовые смеси могут быть перенесены на 50 мл трубки сокола.
6. Спиновые всех клеток после выполнения этой процедуры для каждой пластины.
7. Граф и пластины клеток при плотности 1 х 10 ^ 6 на чашку в средней СМИ DC в новом стерильном 10 блюд см культуры. Вернуться клетки культуры ткани инкубатора.

ДЕНЬ 10-11

Зрелые РС готовы к стимуляции / антиген нагрузки.

9) Дендритные Стимуляция Cell:

1. Использование ЛПС (lipopolyscaccharide) в сочетании с желаемым пептид для активации и пептид нагрузки. В зависимости от исходного ЛПС, различные условия стимуляция может дать лучшие результаты. Кроме того, необходимое количество пептида для представления постоянного тока должны быть оптимизированы. Стимуляция условия в этом протоколе были 100 нг / мл LPS и 100 мкг / мл OVA (яичный альбумин).
2. Нагрузка антиген / отнестись с ЛПС в течение 18-24 часов до сбора урожая / использования.

Дендритные СМИ Cell: стерильный фильтр после всего, была добавлена

Пожалуйста, см. обсуждение в разделе обзор различных дендритных условиях культуры клеток и в результате клетка фенотип дендритных. Эти условия культивирования предназначены для получения зрелых дендритных клеток, которые быстро домой слива лимфатических узлов, 18-24 часов после подкожного введения и представить антиген эффективно.

Первичная DC СМИ: Стерильный фильтр после всего, была добавлена

• 500 мл IMDM (удалить 55-60 мл для конечного объема 500 мл)
• 50 мл инактивированной тепла FBS
• 5 мл 200 мМ L-Gln, конечной концентрации 2 мМ
• 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина (5 мл 10 000 МЕ / мл Пена и 10000 мг / мл Strep акций)
• 50 мкМ B-Me (14,3 M B-Me акции, развести 1:100 в капот химической, использовать 35 ул на 100 мл средств массовой информации в течение 50 мкмоль концентрации)
• 20-30 нг / мл GM-CSF
• 100-400 МЕ / мл IL-4 примерно на 10 - 40 нг / мл

SecondaryDC средств массовой информации для созревания *

100 нг / мл, ФНО-альфа (добавить в первичной DC СМИ)

* Примечание: GM-CSF + IL-4 должна производить незрелые дендритные клетки. Использование GM-CSF + IL4 (400 МЕ / ул) + ФНО-альфа (100 мкг / мл) будет создавать клетки, которые напоминают зрелых моноцитов дендритных клеток. Зрелые дендритные клетки, как известно, не занимать антиген так же эффективно, как незрелые дендритные клетки и культур может иметь эндогенное TNF-освободили из стромальных клеток ^4.

Обсуждение

Дендритные клетки являются ключевыми медиаторами адаптивного иммунного ответа и наиболее эффективным антигенпрезентирующие клетка характеризуется на сегодняшний день. Методы человека и мыши дендритных клеток культуры в литературе различаются по типу цитокинов использовать для влияния на развитие различных дендритных типов клеток. В частности, GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-альфа и гамма-интерферона используются в различных комбинациях для получения зрелых, незрелые, воспалительных и стационарные, как мышиный костного мозга дендритных клеток ...