Простой и конкретный метод был продемонстрирован для флуоресцентной маркировки и усовершенствованные функции обнаружения белков клеточной поверхности, без фракционирования шаг. Дифференциальная обилие белков клеточной поверхности, были проанализированы с использованием двумерных (2-D), электрофорез и Ettan ™ ПГЛП технологии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Селективный маркировки на поверхности клеток белков, используя CyDye ПГЛП Fluor Минимальная Красители
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Поверхностные белки играют центральную роль в способности клеток к реагируют на окружающую среду и взаимодействие с соседними клетками. Они, как известно, индукторы практически всех внутриклеточных сигнальных. Более того, они играют важную роль в экологической адаптации и лечения наркозависимости, и часто участвует в патогенезе заболевания и патологии (1). Белок-белковые взаимодействия присущи сигнальных путей, а также получить более глубокое в этих сложных биологических процессов, чувствительных и надежных методов, необходимых для изучения белков клеточной поверхности. Двумерные (2-D) электрофореза широко используется для обнаружения биомаркеров и другие цели в сложных образцов белков изучать дифференциальные изменения. Сотовые поверхностных белков, частично из-за их низкой численности (1 2% клеточных белков), которые трудно обнаружить в 2-D гель без фракционирования или какой-либо другой тип обогащения. Они также часто слабо представлены в 2-D гелями из-за их гидрофобной природы и высокой молекулярной массой (2). В этом исследовании мы представляем новый протокол для нетронутыми клетки, используя CyDye ПГЛП Fluor минимальным красители для конкретной маркировки и обнаружения этой важной группы белков. Результаты показали, конкретных маркировки большого количества белков клеточной поверхности с минимальной маркировки внутриклеточных белков. Этот протокол является быстрым, простым в использовании, и все три CyDye ПГЛП Fluor минимальным красителей (Су 2, 3 и Су Су 5) может быть использован для обозначения на поверхности клеток белков. Эти функции позволяют мультиплексирования использованием 2-D флуоресцентный гель-электрофореза Разница (2-D ПГЛП) с Ettan ПГЛП технологии и анализ экспрессии белка изменения с помощью DeCyder 2-D Дифференциальный анализ программного обеспечения. Уровень поверхности клеток белков последовало во время сыворотке голодание клеток СНО для различных периодов времени (см. Таблицу 1). Небольшие изменения в изобилии были обнаружены с высокой точностью, и результаты поддерживаются определены статистические методы.
Протокол
Клеточные культуры
- Рост китайского хомячка яичников клеток (СНО-К1) с использованием стандартных процедур культур клеток, в F-12 Хэм среде с GlutaMAX Я, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина сульфат (Invitrogen).
- Биржа питательной среды для бессывороточной СМИ. Этикетка белков клеточной поверхности, были в различные моменты времени с CyDye ПГЛП Fluor Cy3 или Cy5 минимальным красителей (см. раздел клеточной поверхности, маркировки, ниже).
- Бассейн равное количество клеток из каждой точки времени и этикетка с CyDye ПГЛП Fluor Су2. Используйте их в качестве внутреннего стандарта для каждого 2-D геле.
- Большинство экспериментов могут быть выполнены с СНО-К1 клетки, но мышиных эмбриональных фибробластов (3T3 L1) и мышь асцит лимфомы лимфобластов (EL4) также может использоваться (данные не приведены).
- Рост последних двух типов клеток в DMEM среде с GlutaMAX II, но, в противном случае используйте одинаковые условия для CHO-K1 клеток.
Маркировки на поверхности клетки
- Аккуратно отделить прилипшие клетки неферментативно, подсчета и деления на аликвоты 5-10 x106 клеток. Для клеток, растущих в виде суспензии, опустите отсоединения шаг.
- Центрифуга клеточные суспензии около 800 мкг в течение 5 минут. Удалить надосадочную жидкость содержащие среды.
- Вымойте окатышей resuspendion в Сбалансированный Соль 1 мл ледяной Хэнка Решение (HBSS) рН 8,5. Центрифугировали при 800 мкг при 4 ° С в течение 2 минут.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл буфера ледяной маркировки (HBSS рН 8,5, 1 М мочевина).
- Этикетка неповрежденных клетках с 600 пмоль CyDye ПГЛП Fluor минимальным красителей в течение 20 минут на льду в темноте.
- Quench реакцию добавлением 20 мкл 10 мМ лизина. Инкубируйте в течение 10 минут.
- Вымойте поверхность-меченых клеток дважды ресуспендирования в 500 мкл HBSS рН 7,4, с последующим центрифугированием при 800 мкг при 4 ° С в течение 2 минут.
Лизису клеток и фракционирования
- Lyse поверхностно-меченых клеток в 150 мкл холодного буфера для лизиса (7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% CHAPS, 30 мМ Трис, 5 мМ ацетат магния рН 8,5). Оставьте на льду в течение не менее 1 ч с редкими вортексе.
- Центрифуга лизатов при 10 000 мкг при 4 ° С в течение 5 минут. Передача супернатант в новую пробирку. Этот образец не-фракционированного образца, содержащего всех клеточных белков.
- Параллельно с этим, мыть ячейки гранул, как и выше, то фракционирования (при использовании комплекта мембраны фракционирования, Пирс) в мембране и цитоплазме фракций до 2-D электрофореза геля. Мембранной фракции содержит внутренние и клеточных поверхностных белков мембран.
- Для сравнения, следуйте стандартной процедуре Ettan ПГЛП 3 и лизировать, этикетки, и, наконец, фракционирования клеток. Определить концентрацию белка в образцах с помощью 2 - D Квант Kit (GE Healthcare).
2-D электрофореза
- Увлажняет Immobiline DryStrip гели, рН 3-11NL (24 см) с использованием Immobiline DryStrip Reswelling лоток, 24 см в 450 мкл раствора Регидратация DeStreak (0,5% IPG буфера) в течение ночи.
- Применить CyDye меченные образцы (соответствует 50 мкг общего белка), чтобы Immobiline DryStrip гелей анодной загрузки кубок в многообразии и выполнять изоэлектрофокусировки (МЭФ), используя Ettan IPGphor II МЭФ системы в соответствии с инструкциями.
- После МЭФ, равновесие полосы в два этапа и место на вершине большой (26 х 20 см) 12,5% полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Наложение с 0,5% агарозы (в беге буфер, содержащий бромфенола синий). Выполнить 2-D электрофореза использованием Ettan DALTtwelve Большие вертикальные системы на 5 Вт / геля в течение 30 минут, а затем на 15 Вт / гель, пока краситель фронт достигнет нижней части геля.
Изображений и анализа данных
- После завершения 2-D электрофореза, сканирования гелей для Су2, Cy3 или Cy5 использованием Тайфун 9410 Переменная Imager режиме.
- Сравните месте карты из мембранных фракций, цитозольного фракций, а не-фракционированного образцов с использованием DeCyder 2-D Дифференциальный анализ программного обеспечения 4.
После окрашивания
- После обработки изображений, серебряные пятна гели согласно стандартной процедуре 5.
Белки идентификации
- Расти, урожай, мойки и лизировать препаративных количествах (примерно 1 мг общего белка от 10 x106 клетки СНО) клеток, как описано выше для не-фракционированного образца. Используйте Cy5 поверхности клетки помечены образца (см. выше), шип, а также применять вместе с немеченого препаративных количествах белка.
- Проведение 2-D электрофореза, как описано выше, но на этот раз, aplly 600 мкг немеченого Клеточный лизат вместе с 50 мкг поверхности клетки помечены шип с применением анодного чашку. Используйте ссылки маркеров, чтобы правильный выбор места, и место бытьмежду стеклянными пластинами, прежде чем гель литья в соответствии с рекомендациями 3.
- Сканирование геля в Cy5 канала для получения Cy5 поверхности клетки месте карты, после чего общая окраска белка использованием Deep Purple белка общего пятно 3.
- Матч вместе второе место карты, используя DeCyder 2-D программное обеспечение и создать список выбора для всех пятен, соответствующих Cy 5 меченых белков клеточной поверхности. Pick поверхности клеток белков, используя обработку Ettan месте станции, выписка из геля пробок и trypsinate использованием реактора Ettan. Определить использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии.
Таблица 1. Эксперимент Ettan ПГЛП проводилось с использованием образцов сыворотки обедненного клетки помечены в соответствии с поверхности клеток белков маркировки протокола на рисунке 1.
| Образец | Время сыворотке истощения | Маркируется CyDye | Гель номер |
| 1 | - | Cy 3, Cy 2 | 1 |
| 2 | 30 минут | Cy 5, Су 2 | 1 |
| 3 | 2-х часов | Cy 3, Cy 2 | 2 |
| 4 | 4 часа | Cy 5, Су 2 | 2 |
| 5 | 16 часов | Cy 5, Су 2 | 3 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Концентрация белка
Обзор двух рабочих процессов маркировки показан на рисунке 1. Поскольку клетки остаются нетронутыми, когда маркированный в соответствии со клеточной поверхности протокол маркировки белка, только белки клеточной поверхности, подвержены красителя. В стандартном Ettan ПГЛП протокол, клетки лизируют до маркировки и белков внутри, так и вне клетки помечены (рис. 1). Относительное количество красителя белка в клеточной поверхности протокол маркировки белка не известно, так как на ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Мы благодарим профессора Dontscho Kerjaschki, Корина Майрхофер и Сигурд Кригер в Институте клинической патологии, Венский университет, Австрия за сотрудничество.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Набор CyDye DIGE, 2 nmol | Реагент | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| Набор 2-D Quant | Реагент | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Буфер IPG pH 3-11NL | Реагент | GE Healthcare | 17-6004-40 | |
| Полоски Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Реагент | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Инструмент | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| Набор IPGbox | Инструмент | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| Раствор для регидратации DeStreak | Реагент | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Жидкость для покрытия Immobiline DryStrip | Реагент | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Установка для ИЭФ Ettan IPGphor 3 | Прибор | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Манифольд Ettan IPGphor | Компонент прибора | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Устройство для отливки гелей Ettan DALTtwelve | Инструмент | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Блок разделения и блок управления/питания Ettan DALTtwelve | Прибор | GE Healthcare | 80-6466-46 | Блок 230 V: 80-6466-27 |
| Имиджер с переменным режимом Typhoon 9410 | Прибор | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Система Ettan Spot Picker для вырезания пятен | Прибор | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Дигестер Ettan Digester | Прибор | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Споттер Ettan Spotter | Прибор | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| MALDI-TOF Ettan | Прибор | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| Программное обеспечение для дифференциального 2-D анализа DeCyder | Прочее | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| Программное обеспечение для анализа ImageQuant | Прочее | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Мочевина | Реагент | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Реагент | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne дитиотреитол (DTT) | Реагент | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Бромфеноловый синий | Реагент | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Реагент | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Додецилсульфат натрия (SDS) | Реагент | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne глицерин 87% | Реагент | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Реагент | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Реагент | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne персульфат аммония | Реагент | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne глицин | Реагент | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| Набор для 2-D подготовки проб мембранных белков | Реагент | Pierce, Thermo Scientific | 89864 | |
| Стрептомицинсульфат | Реагент | Invitrogen | 15140-122 |
Ссылки
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
- Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
- Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
