Обнаружение микроорганизмов окружающей среды с помощью полимеразной цепной реакции и гель-электрофореза

Полимеразная цепная реакция, или ПЦР, является фундаментальным биологическим методом, который широко применяется для обнаружения и идентификации микроорганизмов, присутствующих в почве, воде и других образцах окружающей среды.

Классически микроорганизмы культивируются в лабораториях с использованием специализированных питательных сред. Тем не менее, многие микробы в естественной среде являются «некультивируемыми» - либо потому, что они имеют очень низкую метаболическую активность или скорость роста, либо потому, что у них очень строгие требования к росту, которые могут быть не воспроизведены в чашке для культивирования. Различия в пригодности к культивированию среди микробов также означают, что при культивировании микроорганизмов из образца окружающей среды их относительная распространенность в культуре может не отражать их фактический уровень в окружающей среде.

Появление ПЦР, которая может специфически амплифицировать даже небольшое количество ДНК, присутствующей в смешанном образце, позволяет быстро обнаруживать и идентифицировать конкретные микробы, представляющие интерес, даже те, которые не поддаются культивированию, в сложном ассортименте организмов, присутствующих в образце окружающей среды.

В этом видео мы познакомим вас с принципами проведения ПЦР. Затем будет обсуждаться общий протокол проведения ПЦР на ДНК, выделенной из образца окружающей среды, с целью обнаружения присутствия интересующего организма. Наконец, будет рассмотрено несколько применений идентификации микробов с помощью ПЦР.

Основная предпосылка ПЦР заключается в использовании повторяющихся циклов последовательных изменений температуры для достижения экспоненциальной амплификации ДНК, обычно с помощью машины, известной как термоамплификатор, для автоматического переключения между различными температурами. Синтез ДНК осуществляется ферментами ДНК-полимеразы, которые получают из бактерий, обитающих в горячих источниках, таких как Thermus aquaticus или «Taq». Эти полимеразы термостабильны, что позволяет им выдерживать высокие температуры, используемые во время ПЦР.

Последовательность-мишень, известная как ампликон, амплифицируется из матрицы ДНК с использованием двух коротких участков нуклеотидов, известных как «праймеры». Из-за высокой специфичности связывания комплементарных нуклеиновых кислот праймеры позволяют проводить целенаправленную амплификацию очень специфических последовательностей, представляющих интерес. Путем разработки праймеров, которые будут амплифицировать только уникальную последовательность или уникальную комбинацию последовательностей из организма, представляющего интерес, ПЦР может быть использована для дифференциального обнаружения наличия ДНК этого организма среди всех генетических материалов, присутствующих в сложном образце окружающей среды.

Каждый цикл ПЦР делится на три фазы. Первая, известная как «денатурация», обычно устанавливается выше 92 ? C и длится около 30 с. Денатурация используется для разбиения молекул ДНК на отдельные нити, чтобы обеспечить протекание реакции амплификации.

Вторая фаза, «отжиг», устанавливается от 2 до 3 ? C ниже нижней из температур плавления двух грунтовок, обычно от 50 до 65 ? С, а также длится около 30 с. Температура плавления — это температура, при которой 50% двухцепочечных молекул ДНК разделяются на одиночные цепи, и таким образом этап отжига позволяет праймерам связываться со своими целевыми участками в матрице ДНК.

Третьей фазой цикла ПЦР является «удлинение» или «удлинение», когда ДНК-полимераза связывается с дуплексом праймер-матриц и катализирует синтез новых цепей. Установлено на 72 ? С для наиболее часто используемой ПЦР-полимеразы, Taq, продолжительность этой фазы зависит от длины ампликона, обычно 30 с на 500 пар оснований. После каждого цикла амплифицированная ДНК снова денатурируется и служит новым шаблоном, что приводит к экспоненциальному увеличению количества продуктов ПЦР.

Как только реакция завершена, продукты ПЦР могут быть определены по размеру на «геле», обычно изготовленном из полимера агарозы, процесс, известный как электрофорез. Электрическое поле прикладывается к гелю, и отрицательные заряды в основе молекул ДНК заставляют их мигрировать к положительному концу поля. Вообще говоря, линейным молекулам ДНК, которые больше, потребуется больше времени, чтобы пройти через гелевую матрицу.

Теперь, когда вы понимаете, как работает ПЦР, давайте рассмотрим, как эта реакция может быть использована для идентификации микроорганизмов в образце окружающей среды.

Для начала рассчитайте объем каждого необходимого реагента на основе количества обрабатываемых образцов плюс дополнительные 10% для учета ошибок пипетирования. Шаблон положительного контроля, который содержит целевую область, должен быть включен для обеспечения работоспособности реакции; а также отрицательный контроль, при котором матрица ДНК не включена, чтобы исключить загрязнение любого из компонентов реакции. Держите фермент Taq-полимеразу на льду, а остальные реагенты и образцы ДНК размораживайте при комнатной температуре в специальном ламинарном проточном колпаке, чтобы предотвратить загрязнение.

После того, как все реагенты оттают, составьте «мастер-микс» реагента, добавив расчетный объем каждого реагента в микрофужную пробирку с низкой связываемостью, что сводит к минимуму расхождения в количествах реагентов из-за адсорбции молекул на поверхности пробирки. Аккуратно перемешайте и центрифугируйте каждый реагент перед добавлением. Как только мастер-смесь будет готова, вортекс перемешать и собрать методом центрифугирования.

Нанесите маркировку на 8-пробирочную ПЦР-полоску, чтобы назначить одну пробирку для каждого образца, включая контроль. Нанесите соответствующее количество мастер-смеси для ПЦР в каждую пробирку полоски. Затем добавьте каждый образец ДНК в соответствующую пробирку.

Надежно наденьте колпачок ленты на полосковую пробирку и кратковременно центрифугируйте в мини-центрифуге с адаптером для полоски. Затем поместите пробирку в термоамплификатор и запустите реакцию в соответствии с соответствующей программой ПЦР.

Во время проведения ПЦР приготовьте агарозный гель для электрофореза продуктов ПЦР. Взвесьте соответствующее количество агарозного порошка для геля с концентрацией, которая может разрешать продукты ПЦР в зависимости от их ожидаемых размеров. Добавьте агарозу в колбу объемом 125 мл, затем добавьте в колбу соответствующий объем буфера для протекания геля, исходя из объема отливки геля, и перемешайте. Разогрейте раствор агарозы в микроволновой печи на высокой мощности в течение 1 минуты. Когда все будет готово, убедитесь, что агароза полностью растворилась, поворачивая колбу, и при необходимости повторите приготовление в микроволновой печи с шагом 30 секунд.

Плотно закрепите колпачок на колбе и охладите агарозный раствор до 50 ? C, поворачивая колбу под проточной холодной водой. После остывания добавьте 1 ? L бромида этидия к агарозе. Поскольку бромид этидия потенциально канцерогенен, обязательно надевайте средства индивидуальной защиты, такие как очки, лабораторный халат и перчатки, устойчивые к бромиду этидия.

Налейте раствор агарозы в лоток для литья гелем с электрофорезом, убедившись, что внутри агарозы не застряли пузырьки воздуха. Поместите в раствор гребень с необходимым количеством лунок. Оставьте гель при комнатной температуре на 20-30 минут для застывания. После того, как гель застынет, осторожно снимите расческу, следя за тем, чтобы не порвать гель в процессе.

Поместите затвердевший гель в камеру электрофореза. Добавьте буфер LB в камеру до тех пор, пока гель не будет просто погружен в воду. На кусочек парапленки нанесите пипеткой «пятно» лестницы ДНК подходящего диапазона для ожидаемого размера ПЦР-продуктов. Извлеките из термоамплификатора ПЦР-пробирки с завершенными реакциями. Соберите конденсат в ПЦР-пробирках путем кратковременного центрифугирования и добавьте 8 ? L каждого образца на парапленку. Прибавьте 2 ? L или 10x загрузите краситель в каждое пятно продукта ПЦР так, чтобы конечная концентрация красителя была 2x.

Загрузите образцы и лестницу в предназначенные для этого лунки в агарозном геле, стараясь не проткнуть гель. После завершения загрузки наденьте крышку на камеру электрофореза и подключите электроды к источнику питания. Поскольку ДНК отрицательно заряжена и мигрирует к положительному электроду, убедитесь, что лунки находятся на стороне, ближе к отрицательному электроду. Включите источник питания и установите его на напряжение, соответствующее размеру камеры электрофореза и используемой буферной системы. Установите электрофорез в положение «бег». Мелкие пузырьки, движущиеся вверх по стенкам камеры, будут наблюдаться, если электрофорез протекает правильно.

Как только фронт красителя достаточно продвинутся вниз по гелю, выключите источник питания. Осторожно транспортируйте гель к тепловизору для визуализации электрофорированных продуктов. С помощью защитного экрана включите ультрафиолетовый свет и визуализируйте полосы ДНК на геле. Проанализируйте положение полос, чтобы увидеть, соответствует ли оно ожидаемой закономерности, указывающей на присутствие интересующего вида в образце окружающей среды.

Теперь, когда вы увидели, как проводится ПЦР, давайте рассмотрим различные способы ее применения для обнаружения микроорганизмов, представляющих интерес в окружающей среде.

Одним из применений микробного обнаружения окружающей среды с помощью ПЦР является идентификация болезнетворных организмов, таких как «поедающая мозг» амеба Naegleria fowleri, одноклеточный организм, обнаруженный в пресных водоемах и нехлорированных бассейнах, который может атаковать нервную систему человека, часто со смертельным исходом. Присутствие этого смертельного микроба в образцах воды или спинномозговой жидкости пациентов с подозрением на беременность можно проверить, выполнив ПЦР с использованием праймеров, нацеленных на уникальные последовательности ДНК в геноме амебы.

Еще одним применением микробной идентификации с помощью ПЦР является проверка на наличие патогенных бактерий у мух, пойманных вблизи заведений общественного питания, в рамках мониторинга общественного здравоохранения и расследования вспышек заболеваний.

Здесь исследователи искали присутствие патогенных бактерий, таких как сальмонелла и листерия, сначала изолируя бактерии как с поверхности тела, так и из пищеварительного канала мух, а затем используя видоспецифичные условия культивирования для обогащения этих видов, представляющих интерес. После извлечения ДНК из любых бактерий, которые были культивированы, для проверки их идентичности использовались коммерчески доступные видоспецифичные наборы для обнаружения ПЦР.

Наконец, с помощью ПЦР можно идентифицировать и дифференцировать различные штаммы устойчивых к антибиотикам патогенных бактерий, таких как золотистый стафилококк, которые представляют серьезную угрозу для общественного здравоохранения.

В этом примере исследователи выделили и культивировали S. aureus из клинических образцов, затем извлекли ДНК из бактериальных колоний и провели ПЦР. Реакции амплификации здесь были «мультиплексированными», что означает, что несколько наборов праймеров, нацеленных на разные уникальные области бактериального генома, были объединены в одну и ту же реакцию. Индивидуальные наборы праймеров были разработаны таким образом, что продукты ПЦР получены из ДНК только некоторых штаммов, но не других, так что в комбинации наблюдались уникальные паттерны полос продукта для каждого штамма.

Вы только что посмотрели видео JoVE о выявлении микроорганизмов с помощью ПЦР. Мы рассмотрели принципы, лежащие в основе полимеразной цепной реакции; протокол проведения ПЦР на ДНК, выделенной из микроорганизмов окружающей среды; и, наконец, несколько конкретных применений этого метода для тестирования организмов, представляющих интерес, в различных типах окружающей среды или клинических образцах. Спасибо за просмотр!