Обнаружение микроорганизмов окружающей среды с помощью полимеразной цепной реакции и гель-электрофореза

1. Сбор образцов

1. Соберите почву с помощью шнека или лопаты на определенную глубину. Если вы собираете почву из ризосферы (узкая область почвы, окружающая корни растений и связанные с ними микробы и находящиеся под их влиянием), собирайте ее непосредственно непосредственно вокруг корней растений, отбивая почву в бочку для сбора.
2. Соберите пробу воды, опустив в воду стерильную пластиковую бутылку, держа конец палочки для погружения.

2. Экстракция и получение нуклеиновых кислот

1. Соберите из образца организмы и вирусы, а также извлеките из них ДНК и РНК. Для получения подробной информации, пожалуйста, обратитесь к обучающему видеоролику JoVE по научной экстракции нуклеиновых кислот в сообществе.
2. Храните извлеченную ДНК в помеченных микрофуговых пробирках. Если ДНК необходимо хранить в течение ночи или в течение более длительного периода времени, заморозьте ее при температуре -20 °C и разморозьте пробирки при комнатной температуре, когда они будут готовы к использованию.
3. Если генетический материал, подлежащий анализу, представляет собой РНК (будь то геном РНК-вирусов или транскрибируемая РНК клеточных организмов), проведите обратную транскрипцию (ОТ) образца для создания комплементарной ДНК (кДНК), прежде чем приступать к ПЦР. Для получения подробной информации, пожалуйста, обратитесь к обучающему видео JoVE по ОТ-ПЦР.

3. Полимеразная цепная реакция

1. Поместите фермент ПЦР (например, Taq-полимеразу) на лед и разморозьте другие реагенты (буфер для ПЦР, dNTP, праймеры) в специальном «чистом» колпаке при комнатной температуре. Фермент хранится при температуре -20 °C, но никогда не замерзает. Он чувствителен к температуре, поэтому его необходимо хранить в прохладном месте, сводя к минимуму воздействие температуры окружающей среды
2. Рассчитайте объем каждого реагента, необходимый для создания «мастер-микса» из всех реагентов, которые являются постоянными среди всех реакций (таблица 1). Обязательно учитывайте положительные (например, шаблон, о котором известно, что он содержит целевую область) и отрицательные (например, отсутствие шаблона) элементы управления при расчетах. Добавьте еще 10% к конечному объему, чтобы учесть ошибку пипетирования. Объемы праймера зависят от анализов на конкретные организмы; Обратитесь к опубликованной литературе за соответствующими значениями.
3. С помощью микропробирки с низким уровнем связывания, которая сводит к минимуму адгезию молекул реагента к пластиковым стенкам, добавьте рассчитанные объемы каждого реагента для сборки мастер-микса. Аккуратно перемешайте и центрифугируйте каждый реагент перед добавлением. Как только мастер-смесь будет готова, вортс перемешать и собрать методом центрифугирования
4. Приготовьте 8-пробирочные ПЦР-полоски. Назначьте пробирку для каждого образца, включая положительный и отрицательный контроль
5. Дозируйте соответствующий объем ПЦР-смеси в каждую пробирку стрипа
6. Добавьте соответствующий объем матрицы ДНК из образцов, а также 5 μл положительной матрицы и 5 μл воды молекулярного качества в качестве отрицательного контроля в соответствующие пробирки для ПЦР.
7. Надежно наденьте крышку на 8-пробирочную полоску и центрифугируйте на несколько секунд с помощью миницентрифуги
8. Поместите полоску на 8 пробирок в термоамплификатор
9. Установите соответствующую программу ПЦР для запуска на термоамплификаторе. Типичная программа состоит из следующих компонентов
   1. Денатурация при 94 °C в течение 3 мин.
   2. 30–40 циклов амплификации: денатурация при 94 °C в течение 30 с, отжиг при специфической для праймера температуре (обычно в пределах 50–60 °C) в течение 30 с и удлинение при 72 °C в течение 30 с/500 п.н.
   3. Окончательное выдержание при 72 °C в течение 7-10 мин.

4. Препарат агарозного геля

1. Исходя из желаемого объема геля и концентрации геля (Таблица 2), отвесьте соответствующее количество агарозного порошка в колбу Эрленмейера объемом 125 мл.
2. Добавьте в колбу соответствующий объем буфера для бегущего геля и перемешивайте колбу вручную.
3. Нагрейте буферно-агарозную смесь в микроволновой печи на высокой мощности в течение 1 минуты.
4. Достаньте колбу из микроволновой печи и покрутите вручную, чтобы убедиться, что вся агароза растворилась. Если агароза не полностью растворилась, повторите разогревание в микроволновой печи с шагом в 30-х секунд.
5. Плотно закрепив крышку на колбе, охладите ее до 50 °C, вращая под проточной холодной водой.
6. Добавьте 1 мкл бромида этидия (EtBr) в агарозную смесь с помощью микропипета, предназначенного для EtBr. EtBr — это краситель, который связывает двухцепочечные нуклеиновые кислоты и флуоресцирует оранжевым цветом при освещении ультрафиолетовым светом. Обратите внимание, что EtBr является потенциально канцерогенным, поэтому необходимо носить средства индивидуальной защиты (очки, лабораторный халат, перчатки, устойчивые к EtBr).
7. Вылейте расплавленный гель в лоток для литья гелем с электрофорезом. Убедитесь, что внутри агарозы не застряли пузырьки. Поместите расческу в гель и надежно зажмите. Подождите примерно 20-30 минут, чтобы гель застыл.
8. Как только гель застынет, осторожно снимите расческу, не вызывая разрывов в геле. Гребень создает в геле отверстия для загрузки образцов.

5. Гель-электрофорез

1. Поместите застывший агарозный гель в камеру электрофореза.
2. Добавьте в камеру соответствующий буфер для работы до тех пор, пока гель не будет едва погружен в воду.
3. На кусочек парапленки пипеткой нанесите пятна загрузки концентрата красителя. Также включают в себя лестницу ДНК подходящего диапазона для ожидаемых размеров ПЦР-продуктов. В качестве альтернативы используйте свежий набор микрофуговых пробирок, по одной для каждого образца.
4. После завершения ПЦР извлеките эту 8-пробирочную полоску из термоамплификатора и кратко центрифугируйте для сбора конденсата. Добавьте соответствующий объем продукта ДНК в загрузочный краситель и пипеткой вверх и вниз для смешивания. Например, 2 мкл 10-кратного загрузочного красителя смешивают с 8 мкл образца для получения конечного объема 10 мкл, при этом краситель составляет 1х.
5. Пипеткой нанесите каждую смесь красителя и образца в предназначенные для этого лунки в агарозном геле, стараясь не проколоть лунки.
6. Подсоедините электроды к камере электрофореза. ДНК заряжена отрицательно, поэтому она «бежит» к положительному электроду. Поэтому подключите положительный электрод к противоположной стороне камеры, куда были загружены скважины. Установите напряжение источника питания на напряжение, соответствующее буферной системе и размеру гелевой камеры, и установите его на работу. Должны быть видны небольшие пузырьки, движущиеся вверх по стенкам камеры, если электрофорез проходит правильно.
7. Как только фронт красителя достаточно продвинутся вниз по гелю, выключите источник питания. Осторожно перенесите гель в трансиллюминатор или визуальный формирователь изображения и включите ультрафиолетовый свет, чтобы визуализировать полосы ДНК на геле.
8. Проанализируйте размер полосы и положение на геле. Сравните положение полос между образцами и положительным контролем, чтобы определить, присутствует ли в образце ДНК исследуемого организма (рис. 1).

мм Сталь

компонент	Объем на тюбик (μл)	Объем на 5 пробирок (μл)	Окончательная концентрация
10x Ex Taq буфер	5,0	25	1x
2,5 мМ dNTP	4.0	20	0,2 мМ
Грунтовка для переднего хода*	2.0	10	400 нМ
Обратный грунтовка*	2.0	10	400 нМ
Молекулярный H2O	31,75	158,75	- T
Ex Taq	0,25	1.25	2,5 U
Смесь для ПЦР	45	225

Таблица 1. Объемы реагентов для мастер-микса ПЦР. * Объемы праймера варьируются в зависимости от анализа организма. Отрегулируйте объем молекулярной воды так, чтобы конечный объем составил 45 μл. Объемы других компонентов не должны изменяться.

См.

Рекомендуемый % агарозы	Оптимальное разрешение для линейных фрагментов ДНК (пар оснований)
0,5	1 000-30 000
0,7	800-12 000
1.0	500-10 000
1.2	400-7 000
1.5	200-3 000
2.0	50-2,00

Таблица 2. Диапазоны размеров фрагментов ДНК оптимально разрешаются различными процентами агарозного геля.