How does qPCR differ from standard PCR in measuring microorganisms?

qPCR adds fluorescent chemicals to the reaction, allowing real-time visualization of PCR product synthesis at each cycle. This enables quantification of the target DNA sequence in the original sample by measuring the threshold cycle (Ct), the cycle where fluorescent products exceed background. Standard PCR only detects presence or absence of DNA, while qPCR provides quantitative measurement.

What is the threshold cycle and why is it important in qPCR analysis?

The threshold cycle (Ct), also called the quantification cycle (Cq), is the PCR cycle at which fluorescent product signal exceeds background noise. It is important because it directly correlates to the amount of target DNA in the original sample. Lower Ct values indicate more starting template, allowing researchers to quantify microorganism concentrations by comparing Ct values between samples and known standards.

What are the two main types of fluorescent molecules used in qPCR?

The first type uses fluorescent dyes that bind specifically to double-stranded DNA and only fluoresce when bound. The second uses a probe—a short DNA sequence designed against a specific target—chemically attached to both a fluorescent dye and a quencher molecule. When the polymerase degrades the probe during synthesis, the dye separates from the quencher, allowing fluorescence detection.

Why can qPCR detect microorganisms that culture-based methods cannot?

qPCR identifies microorganisms by detecting specific DNA sequences rather than requiring live cultures. Since only 1 to 10 percent of environmental microorganisms are culturable using classical techniques, qPCR enables detection of non-culturable species. However, qPCR detects DNA from both living and dead organisms, limiting its ability to distinguish actively growing microbes from inactive populations.

How is rhizosphere soil collected for qPCR virus detection?

Rhizosphere soil is the zone approximately 7 millimeters around plant roots influenced by roots and their symbiotic microorganisms. To collect it, carefully extract the plant from the ground and remove excess bulk soil by striking it. Package the plant for lab processing, then use a sterile spatula to scrape the desired soil into a collection vessel for virus extraction and RNA analysis.

What role does propidium monoazide play in distinguishing live from dead microorganisms?

Propidium monoazide (PMA) is a chemical that enters only dead cells, where it binds to DNA and inhibits subsequent enzymatic reactions like PCR. By adding PMA before qPCR, researchers can selectively prevent amplification from dead microorganisms, allowing differentiation between viable and non-viable populations. This overcomes a major limitation of standard qPCR methodology.

How can qPCR quantify total bacterial communities in environmental samples?

Rather than targeting individual bacterial species, scientists design qPCR primers against highly conserved genes found in all bacteria. This approach quantifies the total bacterial community present in samples such as food, agricultural, or fecal samples. By measuring the combined DNA from all bacteria, researchers obtain an overall assessment of bacterial content without identifying specific species.

Количественное определение микроорганизмов и вирусов окружающей среды с помощью количественной ПЦР

0 просмотров09:57 мин.

1. Коллекция образцов

Соберите грунт с помощью шнека или лопаты на определенную глубину. При сборе почвы из ризосферы собирайте почву только в пределах 7 мм вокруг корня растения, отбивая лишнюю почву от корня и соскребая нужную почву в бочку для сбора.
Поместите стерильную бутылочку Nalgene в палочку для погружения. Возьмитесь за конец палочки и наберите воды, погрузив бутылку в воду. Поставьте бутылку в холодильник со льдом.
Передача образцов в лабораторию.

2. Экстракция нуклеиновых кислот

Чтобы выделить микроорганизмы из собранных образцов и извлечь из них ДНК и/или РНК, пожалуйста, посмотрите видео JoVE Science Education об экстракции нуклеиновых кислот в сообществе.

3. Обратная транскрипция

Если анализируемый генетический материал представляет собой РНК, его необходимо использовать для получения комплементарной ДНК (кДНК) с помощью обратной транскрипции, прежде чем приступать к ПЦР. Для получения подробной информации, пожалуйста, обратитесь к обучающему видео JoVE по ОТ-ПЦР.

4. Настройка qPCR

Достаньте реагенты, хранящиеся при температуре -20 °C, и разморозьте их на льду или при комнатной температуре в чистом колпаке. Реагенты, используемые в этом примере, включают реакционную смесь для количественной ПЦР (в зависимости от используемой машины для количественной ПЦР; содержит ДНК-полимеразу), прямые и обратные праймеры, а также зонд TaqMan. Последовательности праймера и зонда разрабатываются с использованием последовательностей, специфичных для перечисляемого организма. Обратитесь к современной литературе, чтобы найти интересующие вас последовательности. В данном примере будет использоваться реагентная система Roche Light Cycler 480 Probes Mix. Вирус легкой крапчатости перца будет перечислен в пробе воды. ^1,2 Смотрите Таблица 1 для последовательностей праймеров и зондов.
Размораживание экстрагированной (c)ДНК из образцов и положительной контрольной ДНК (которая состоит из специфичных для организма последовательностей, клонированных в бактериальные плазмиды) при комнатной температуре.
Подготовьте шаблон таблицы на 96 ячеек, напоминающий планшет для количественной ПЦР на 96 лунок. Пометьте каждую ячейку реакцией, которая будет загружена на пластину. Включите реакции для каждого образца и стандарт в трех экземплярах, а также для положительного контроля и отрицательного контроля, например, реакцию без ДНК.
Рассчитайте объемы реагентов, необходимые для реакционной «мастер-микса», которая включает в себя все реактивы, которые являются постоянными среди реакций, на основе инструкций производителя и литературы. Подготовьте достаточное количество мастер-смеси для тройных реакций для всех образцов плюс контроль, а также дополнительные 10% для учета ошибок пипетирования. Образец рецепта мастер-смеси см. в таблице Таблица 2.
Работая в чистом колпаке, как только все реагенты полностью разморозятся, добавьте рассчитанное количество каждого реагента в пробирку с низким уровнем связывания объемом 1,5 мл для создания мастер-микса. Вортексируйте и кратковременно миницентрифугируйте каждый реагент перед добавлением. Меняйте наконечник пипетки между каждым реагентом, чтобы предотвратить загрязнение и обеспечить правильную концентрацию. После того, как все реагенты были добавлены, вортекс и миницентрифужную пробирку с исходной смесью для обеспечения однородности.
Квотируйте соответствующий объем мастер-смеси в каждую предназначенную лунку в 96-луночном ПЦР-планшете.
Добавьте соответствующий объем образца (c)ДНК, плазмиды положительного контроля и отрицательного контроля (вода молекулярного качества) в специальные скважины.
После того, как все образцы и контрольные элементы будут добавлены, пломбируйте пластину герметизирующей пленкой. Используйте инструмент для герметизации, чтобы вытолкнуть воздух из-под фольги и предотвратить образование пузырей. Аккуратно оторвите края фольги.
Центрифугируйте герметичный 96-луночный планшет в центрифуге с планшетом-держателем, чтобы собрать смесь на дне каждой лунки. Обязательно используйте пластину противовеса, чтобы убедиться, что центрифуга будет правильно сбалансирована во время вращения. Импульсируйте центрифугу до 1000 об/мин, затем дайте центрифуге медленно остановиться без тормозов.

5. Операция qPCR

Поместите герметичную 96-луночную пластину в машину для количественной ПЦР. Убедитесь, что аппарат показывает его готовность к запуску.
Следуйте инструкциям машины для количественной ПЦР, чтобы правильно ввести всю информацию, необходимую программному обеспечению, затем запустите машину для количественной ПЦР.
После того, как машина завершит работу, программное обеспечение сможет использовать известные концентрации положительного контроля для расчета количества кДНК в каждой реакции. Затем можно рассчитать количество вируса в исходном образце на основе процессов разбавления, фильтрации, концентрирования, амплификации и/или экстракции, выполненных для получения образца ДНК.

Реагент	Последовательность (5' → 3')	Объем (μЛ / лунка)	Финальная конс.
Передний праймер	GAGTGGTTTGACCTTAACGTTTGA	2.25	900 нм
Обратный праймер	TTGTCGGTTGCAATGCAAGT	2.25	900 нМ
Зонд	FAM-CCTACCGAAGCAAATG-BHQ1	1.0	200 нМ

Таблица 1. Образцы праймерных и зондовых последовательностей для выявления вируса легкой крапчатости перца.

Реагент	Объем (μL / скважина)	Количество колодцев	Объем мастер-микса (μL)
LC 480 Микс	12.5	26	325
Молекулярный H₂O	4.5		117
Передний праймер	2.25		58.5
Обратный праймер	2.25		58.5
Зонд	1.0		26
Итого	22.5		585