2.9: Количественное определение микроорганизмов и вирусов окружающей среды с помощью количественной ПЦР

1. Коллекция образцов

1. Соберите грунт с помощью шнека или лопаты на определенную глубину. При сборе почвы из ризосферы собирайте почву только в пределах 7 мм вокруг корня растения, отбивая лишнюю почву от корня и соскребая нужную почву в бочку для сбора.
2. Поместите стерильную бутылочку Nalgene в палочку для погружения. Возьмитесь за конец палочки и наберите воды, погрузив бутылку в воду. Поставьте бутылку в холодильник со льдом.
3. Передача образцов в лабораторию.

2. Экстракция нуклеиновых кислот

1. Чтобы выделить микроорганизмы из собранных образцов и извлечь из них ДНК и/или РНК, пожалуйста, посмотрите видео JoVE Science Education об экстракции нуклеиновых кислот в сообществе.

3. Обратная транскрипция

1. Если анализируемый генетический материал представляет собой РНК, его необходимо использовать для получения комплементарной ДНК (кДНК) с помощью обратной транскрипции, прежде чем приступать к ПЦР. Для получения подробной информации, пожалуйста, обратитесь к обучающему видео JoVE по ОТ-ПЦР.

4. Настройка qPCR

1. Достаньте реагенты, хранящиеся при температуре -20 °C, и разморозьте их на льду или при комнатной температуре в чистом колпаке. Реагенты, используемые в этом примере, включают реакционную смесь для количественной ПЦР (в зависимости от используемой машины для количественной ПЦР; содержит ДНК-полимеразу), прямые и обратные праймеры, а также зонд TaqMan. Последовательности праймера и зонда разрабатываются с использованием последовательностей, специфичных для перечисляемого организма. Обратитесь к современной литературе, чтобы найти интересующие вас последовательности. В данном примере будет использоваться реагентная система Roche Light Cycler 480 Probes Mix. Вирус легкой крапчатости перца будет перечислен в пробе воды. ^1,2 Смотрите Таблица 1 для последовательностей праймеров и зондов.
2. Размораживание экстрагированной (c)ДНК из образцов и положительной контрольной ДНК (которая состоит из специфичных для организма последовательностей, клонированных в бактериальные плазмиды) при комнатной температуре.
3. Подготовьте шаблон таблицы на 96 ячеек, напоминающий планшет для количественной ПЦР на 96 лунок. Пометьте каждую ячейку реакцией, которая будет загружена на пластину. Включите реакции для каждого образца и стандарт в трех экземплярах, а также для положительного контроля и отрицательного контроля, например, реакцию без ДНК.
4. Рассчитайте объемы реагентов, необходимые для реакционной «мастер-микса», которая включает в себя все реактивы, которые являются постоянными среди реакций, на основе инструкций производителя и литературы. Подготовьте достаточное количество мастер-смеси для тройных реакций для всех образцов плюс контроль, а также дополнительные 10% для учета ошибок пипетирования. Образец рецепта мастер-смеси см. в таблице Таблица 2.
5. Работая в чистом колпаке, как только все реагенты полностью разморозятся, добавьте рассчитанное количество каждого реагента в пробирку с низким уровнем связывания объемом 1,5 мл для создания мастер-микса. Вортексируйте и кратковременно миницентрифугируйте каждый реагент перед добавлением. Меняйте наконечник пипетки между каждым реагентом, чтобы предотвратить загрязнение и обеспечить правильную концентрацию. После того, как все реагенты были добавлены, вортекс и миницентрифужную пробирку с исходной смесью для обеспечения однородности.
6. Квотируйте соответствующий объем мастер-смеси в каждую предназначенную лунку в 96-луночном ПЦР-планшете.
7. Добавьте соответствующий объем образца (c)ДНК, плазмиды положительного контроля и отрицательного контроля (вода молекулярного качества) в специальные скважины.
8. После того, как все образцы и контрольные элементы будут добавлены, пломбируйте пластину герметизирующей пленкой. Используйте инструмент для герметизации, чтобы вытолкнуть воздух из-под фольги и предотвратить образование пузырей. Аккуратно оторвите края фольги.
9. Центрифугируйте герметичный 96-луночный планшет в центрифуге с планшетом-держателем, чтобы собрать смесь на дне каждой лунки. Обязательно используйте пластину противовеса, чтобы убедиться, что центрифуга будет правильно сбалансирована во время вращения. Импульсируйте центрифугу до 1000 об/мин, затем дайте центрифуге медленно остановиться без тормозов.

5. Операция qPCR

1. Поместите герметичную 96-луночную пластину в машину для количественной ПЦР. Убедитесь, что аппарат показывает его готовность к запуску.
2. Следуйте инструкциям машины для количественной ПЦР, чтобы правильно ввести всю информацию, необходимую программному обеспечению, затем запустите машину для количественной ПЦР.
3. После того, как машина завершит работу, программное обеспечение сможет использовать известные концентрации положительного контроля для расчета количества кДНК в каждой реакции. Затем можно рассчитать количество вируса в исходном образце на основе процессов разбавления, фильтрации, концентрирования, амплификации и/или экстракции, выполненных для получения образца ДНК.

Таблица 1. Образцы праймерных и зондовых последовательностей для выявления вируса легкой крапчатости перца.

Таблица 2. Объемы реагентов для индивидуальной реакции и мастер-микса.

Появление количественной полимеразной цепной реакции, или количественной ПЦР, позволило количественно определить количество любого микроорганизма в образце окружающей среды.

Как и стандартная ПЦР, кПЦР идентифицирует микроорганизмы путем обнаружения наличия или отсутствия последовательностей ДНК, специфичных для интересующих организмов. Это позволяет обнаруживать микробы, которые не могут быть культивированы в лаборатории, что позволяет анализировать гораздо более широкий спектр микроорганизмов окружающей среды. Кроме того, количественная ПЦР позволяет количественно оценить количество ДНК. Но в то же время методологии ПЦР обнаруживают ДНК всех мертвых или живых организмов, ограничивая возможность искать в образце только активно растущие микробы.

В этом видео будут рассмотрены химические инновации, которые отличают кПЦР от обычной ПЦР, объяснено, как кПЦР может быть использована для количественного измерения ДНК, продемонстрируется протокол использования кПЦР для обнаружения РНК-вируса в образцах почвы и, наконец, показано, как кПЦР применяется в микробиологии окружающей среды сегодня.

Основные принципы количественной ПЦР те же, что и в обычной ПЦР - повторяющиеся циклы отжига праймера до матрицы, удлинения продукта ПЦР и денатурации продукта из матрицы, что приводит к экспоненциальной амплификации интересующей целевой последовательности, известной как ампликон, из пула исходного материала.

Инновация количественной ПЦР заключается в добавлении в реакцию флуоресцентных химических веществ, что позволяет непосредственно визуализировать синтез продукта ПЦР в каждом цикле в «реальном времени» специализированными амплификаторами, что дает возможность количественно оценить количество матричной последовательности в исходном образце. Количество обычно измеряется с точки зрения порогового цикла, сокращенно Ct, также известного как цикл количественного определения или Cq, который представляет собой цикл ПЦР, при котором количество флуоресцентных продуктов превышает фоновый уровень.

Количественная оценка может быть относительной, когда значение Ct одной последовательности сравнивается с значением другой стандартной или контрольной последовательности; относительная величина равна двум, возведенному в степень разности Ct. В качестве альтернативы, если ряд ДНК известного количества прогоняется рядом с образцами в реакции, можно получить стандартную кривую, сравнивающую значение флуоресценции с количеством ДНК, и позволяющую количественно определить ДНК образца абсолютно.

Существует два основных типа флуоресцентных молекул, используемых в количественной ПЦР. В одном случае в реакцию включаются флуоресцентные красители, которые специфически связываются с двухцепочечной ДНК. Краситель флуоресцирует только при связывании с ДНК, что позволяет количественно определить количество двухцепочечного продукта ДНК.

В другом методе короткий участок ДНК, известный как зонд, создается против определенной последовательности-мишени, представляющей интерес. Зонд химически присоединен к флуоресцентному красителю, а также к молекуле «гасителя», которая подавляет сигнал флуоресценции от красителя при нахождении в непосредственной близости. Фермент полимераза, который синтезирует продукт ДНК, обладает разрушающей ДНК активностью, которая приводит к тому, что флуоресцентная молекула «высвобождается» из зонда, тем самым отделяя краситель от гасителя и позволяя обнаруживать сигнал флуоресценции.

Теперь, когда вы понимаете принципы, лежащие в основе количественной ПЦР, давайте рассмотрим протокол использования этого метода для идентификации РНК-вируса, который заражает растения, вируса легкой крапчатости перца, из образцов почвы.

В ходе этой демонстрации образец будет взят из ризосферы, зоны почвы примерно на 7 мм вокруг корней растений, на которую влияют корни и их симбиотические микроорганизмы.

Чтобы собрать ризосферную почву, сначала осторожно извлеките интересующее растение из земли, а затем ударьте по нему, чтобы удалить как можно больше лишнего сыпучего грунта. Упакуйте растение для дальнейшей обработки в лаборатории.

После доставки образцов обратно в лабораторию с помощью стерильного шпателя соскребите нужную почву в сосуд для сбора. Затем соберите вирус из почвы и извлеките РНК.

После того, как РНК будет собрана из образца, преобразуйте ее в комплементарную или кДНК с помощью обратной транскрипции. Пожалуйста, обратитесь к видео JoVE SciEd о ПЦР с обратной транскрипцией для получения подробной информации об этой процедуре.

Когда вы будете готовы к проведению количественной ПЦР, разморозьте замороженные реагенты при комнатной температуре в специальном колпаке с ламинарным потоком и положите на лед после оттаивания. Компоненты реагентов, содержащие фермент ДНК-полимеразу, всегда следует держать на льду.

Разморозьте образец кДНК и положительную контрольную ДНК, такую как кольцевой участок ДНК, известный как плазмида, в который клонирован интересующий вас ампликон.

Перед сборкой реакций в 96-луночном планшете для количественной ПЦР подготовьте шаблон таблицы на 96 клеток на бумаге и пометьте каждую ячейку реакцией, которая будет загружена в планшет. Включите реакции для каждого образца и стандарт в трех экземплярах, а также для положительного контроля и отрицательного контроля, например, реакцию без ДНК.

Рассчитайте объемы реагентов, необходимые для реакционной «мастер-микса», которая включает в себя все реагенты, которые являются постоянными среди реакций. Подготовьте достаточное количество мастер-смеси для тройных реакций для всех образцов плюс контроль, а также дополнительные 10% для учета ошибок пипетирования.

После того, как реагенты разморозятся, соберите основную смесь в микрофуг-пробирку объемом 1,5 мл с низкой адсорбцией. Для этого нужно кратковременно перемешать каждый реагент в вихре, тщательно перемешать, собрать любую жидкость со стороны пробирок с помощью мини-центрифуги, и дозировать реактив в микрофугированную пробирку. Обязательно используйте новые наконечники для пипетки для каждого компонента реакции. После того как все реагенты были добавлены, вортекс перемешать и центрифугировать. Затем распределите соответствующее количество исходной смеси в предназначенные для этого лунки на ПЦР-планшете.

Затем сделайте вихревую и центрифужную обработку каждой пробирки с образцом и контрольной ДНК и пипетируйте соответствующее количество в соответствующие лунки на ПЦР-планшете. После добавления образцов запечатайте пластину герметизирующей пленкой и используйте инструмент для герметизации, чтобы полностью выровнять уплотнение и вытолкнуть любые пузырьки воздуха. Осторожно оторвите неклейкие выступы с торцов пломбы.

Для полного сбора реакционной смеси на дно лунок поместите реакционную пластину в центрифугу с пластиной-держателем и правильно отбалансируйте ротор с пластиной противовеса. Импульсная центрифугирование пластины с частотой до 1 000 об/мин, затем дайте центрифуге медленно остановиться без тормозов.

Поместите реакционную пластину в машину для количественной ПЦР. Установите программу ПЦР в соответствии со спецификацией производителя, установив температуру плавления в соответствии с используемой парой праймеров. Настройте программу реакции на запуск.

После завершения программы количественной ПЦР программное обеспечение сможет использовать известные концентрации положительного контроля для расчета количества кДНК в каждой реакции. Затем можно рассчитать количество вируса в исходном образце.

После завершения программы количественной ПЦР программное обеспечение сможет использовать известные концентрации положительного контроля для расчета количества кДНК в каждой реакции.

С помощью результатов количественной ПЦР, объема, переданного в лунки, извлечения из почвы и фактора обратной транскрипции, можно рассчитать количество вирусов в исходном образце почвы.

Теперь, когда вы знаете, как проводится количественная ПЦР, давайте рассмотрим, как ее можно использовать для анализа различных образцов окружающей среды.

qPCR может быть использована для количественной оценки количества вирусов, извлеченных из множества различных типов образцов. В этом приложении два различных вида аденовирусов были концентрированы из проб воды с помощью ряда различных методов. Затем ДНК извлекали из вирусов и подвергали количественной ПЦР для оценки относительной эффективности методов концентрирования.

Еще одним применением подсчета микроорганизмов на основе количественной ПЦР является количественная оценка содержания бактерий в образцах продуктов питания и сельскохозяйственных культур — в данном примере это образцы кала и помета с птицеферм. Вместо того, чтобы нацеливаться на отдельные виды, ученые провели кПЦР с использованием праймеров против высококонсервативного гена, обнаруженного у всех бактерий, и количественно оценили общее бактериальное сообщество, обнаруженное в образцах.

Наконец, как упоминалось ранее, одним из недостатков традиционной методологии количественной ПЦР является то, что живые и мертвые микробы не могут быть различимы. Однако, добавив химическое вещество, известное как моноазид пропидия, или PMA, которое может проникать в мертвые клетки только там, где оно связывается с ДНК, чтобы ингибировать последующие ферментативные реакции, такие как ПЦР, исследователи смогли различить живые и мертвые культуры E. coli O157:H7, распространенного патогенного штамма, обнаруженного в загрязненной пище и воде.

Вы только что посмотрели введение JoVE в количественную оценку микроорганизмов и вирусов окружающей среды с помощью количественной ПЦР. Теперь вы должны понять, как работает кПЦР, как использовать кПЦР для измерения количества микроба в образце окружающей среды, а также о некоторых применениях этого метода. Спасибо за просмотр!