Экстракция ДНК сообществ из бактериальных колоний

1. Экстракция ДНК бактериального сообщества

1. Для начала процедуры отвесьте 100 г просеянного грунта. Добавьте его в полипропиленовый сосуд и добавьте 100 мл экстракционного буфера, состоящего из трис-буфера, обработанного ЭДТА для стимулирования высвобождения бактерий из почвенного матрикса, затем встряхните вручную.
2. Далее взвесьте 100 г стеклянных шариков и добавьте их в емкость для смешивания. Взбалтывайте образец в течение 5 мин с помощью устройства для взбивания бусин или механического встряхивателя на запястье в течение 15 мин. Добавьте в смесь 10 мл 20% додецилсульфата натрия, или SDS, затем перемешайте еще минуту. Инкубировать при высокой температуре 60 - 65 °C в течение 60 мин.
3. Равномерно распределите образец по отдельным пробиркам объемом 50 мл и центрифугируйте в течение 10 минут при плотности 6000 x g. Переложите надосадочную жидкость из пробирок в один стерильный контейнер. Далее повторите экстракцию на почвенной грануле, как описано ранее, используя свежий объем буфера для экстракции.
4. Далее добавьте общий объем обработанной надосадочной жидкости, примерно 200 мл, в чистую 50-мл пробирку, заполненную наполовину раствором 30% полиэтиленгликоля и 1,6 М хлорида натрия. Переверните бутылки несколько раз вручную, чтобы перемешать, и выдержите при комнатной температуре в течение 2 часов. Центрифугируйте образцы при давлении 10 000 x g в течение 20 минут для гранулирования ДНК.
5. Осторожно удалите надосадочную жидкость из пробирки центрифуги, оставив после себя частично очищенную гранулу нуклеиновой кислоты. Добавьте 20 мл TE Buffer и 1,5 мл 7,5 М раствора ацетата калия для ресуспендирования гранулы, затем вортекс. Поместите суспензию на лед на 5 минут. Центрифугируйте при 16 000 x g в течение 30 минут при 4 °C для осаждения белков и полисахаридов.
6. Затем добавьте в образец РНКазу и протеиназу К, аккуратно перемешайте вручную и оставьте на некоторое время. Добавьте эквивалентное количество фенола:хлороформа:изоамилового спирта (соотношение смеси 25:24:1) в экстрагируемую суспензию и аккуратно перемешайте вручную. Центрифугируйте препарат в течение 10 минут при 13 000 x g. Осторожно извлеките сосуд из центрифуги, и обратите внимание на два слоя.
7. Нижний, более тяжелый слой состоит из фенола:хлороформа:изоамилового спирта и экстрагированного мусора, а верхний слой является водным и содержит ДНК. Поместите водную фазу в стерильный сосуд, добавьте эквивалентный объем изопропанола и осторожно переверните, чтобы инициировать осаждение ДНК. Выдерживать суспензию при комнатной температуре в течение 2 ч. Гранулируйте очищенную ДНК центрифугированием при концентрации 16 000 x g в течение 30 минут. Осторожно удалите надосадочную жидкость, так как гранулированная ДНК может быть видна или не видна на дне сосуда, а затем повторно суспендируйте в 1 мл TE Buffer.
8. С помощью спектрофотометра или флуориметра количественного определения ДНК/РНК измерьте уровень ДНК, извлеченной из образца. Количество ДНК оценивается по показаниям 260 нм. Показатель поглощения 1,0 эквивалентен 50 мкг ДНК на мл раствора. Если концентрация слишком высока для точных показаний, разбавьте суспензию в соотношении 1:10 или в соотношении 1:100 с помощью молекулярной воды.
9. Чистота ДНК оценивается по соотношению показаний при 260 нм к 280 нм. Значение > 1,7 указывает на относительно чистую ДНК. Максимальное теоретическое значение — 2,0.