2.6: Экстракция ДНК сообществ из бактериальных колоний

1. Экстракция ДНК бактериального сообщества

1. Для начала процедуры отвесьте 100 г просеянного грунта. Добавьте его в полипропиленовый сосуд и добавьте 100 мл экстракционного буфера, состоящего из трис-буфера, обработанного ЭДТА для стимулирования высвобождения бактерий из почвенного матрикса, затем встряхните вручную.
2. Далее взвесьте 100 г стеклянных шариков и добавьте их в емкость для смешивания. Взбалтывайте образец в течение 5 мин с помощью устройства для взбивания бусин или механического встряхивателя на запястье в течение 15 мин. Добавьте в смесь 10 мл 20% додецилсульфата натрия, или SDS, затем перемешайте еще минуту. Инкубировать при высокой температуре 60 - 65 °C в течение 60 мин.
3. Равномерно распределите образец по отдельным пробиркам объемом 50 мл и центрифугируйте в течение 10 минут при плотности 6000 x g. Переложите надосадочную жидкость из пробирок в один стерильный контейнер. Далее повторите экстракцию на почвенной грануле, как описано ранее, используя свежий объем буфера для экстракции.
4. Далее добавьте общий объем обработанной надосадочной жидкости, примерно 200 мл, в чистую 50-мл пробирку, заполненную наполовину раствором 30% полиэтиленгликоля и 1,6 М хлорида натрия. Переверните бутылки несколько раз вручную, чтобы перемешать, и выдержите при комнатной температуре в течение 2 часов. Центрифугируйте образцы при давлении 10 000 x g в течение 20 минут для гранулирования ДНК.
5. Осторожно удалите надосадочную жидкость из пробирки центрифуги, оставив после себя частично очищенную гранулу нуклеиновой кислоты. Добавьте 20 мл TE Buffer и 1,5 мл 7,5 М раствора ацетата калия для ресуспендирования гранулы, затем вортекс. Поместите суспензию на лед на 5 минут. Центрифугируйте при 16 000 x g в течение 30 минут при 4 °C для осаждения белков и полисахаридов.
6. Затем добавьте в образец РНКазу и протеиназу К, аккуратно перемешайте вручную и оставьте на некоторое время. Добавьте эквивалентное количество фенола:хлороформа:изоамилового спирта (соотношение смеси 25:24:1) в экстрагируемую суспензию и аккуратно перемешайте вручную. Центрифугируйте препарат в течение 10 минут при 13 000 x g. Осторожно извлеките сосуд из центрифуги, и обратите внимание на два слоя.
7. Нижний, более тяжелый слой состоит из фенола:хлороформа:изоамилового спирта и экстрагированного мусора, а верхний слой является водным и содержит ДНК. Поместите водную фазу в стерильный сосуд, добавьте эквивалентный объем изопропанола и осторожно переверните, чтобы инициировать осаждение ДНК. Выдерживать суспензию при комнатной температуре в течение 2 ч. Гранулируйте очищенную ДНК центрифугированием при концентрации 16 000 x g в течение 30 минут. Осторожно удалите надосадочную жидкость, так как гранулированная ДНК может быть видна или не видна на дне сосуда, а затем повторно суспендируйте в 1 мл TE Buffer.
8. С помощью спектрофотометра или флуориметра количественного определения ДНК/РНК измерьте уровень ДНК, извлеченной из образца. Количество ДНК оценивается по показаниям 260 нм. Показатель поглощения 1,0 эквивалентен 50 мкг ДНК на мл раствора. Если концентрация слишком высока для точных показаний, разбавьте суспензию в соотношении 1:10 или в соотношении 1:100 с помощью молекулярной воды.
9. Чистота ДНК оценивается по соотношению показаний при 260 нм к 280 нм. Значение > 1,7 указывает на относительно чистую ДНК. Максимальное теоретическое значение — 2,0.

Экстракция ДНК бактериального сообщества — это процесс, при котором ДНК получают из нескольких видов бактерий в сообществе в течение одной процедуры экстракции.

Традиционный анализ микробных сообществ в почве обычно включает в себя культуральные анализы с использованием методологии разбавления и нанесения покрытий на различные селективные среды. Тем не менее, многие бактерии плохо растут в лабораторных условиях или в конкретных выбранных условиях питательной среды, что означает, что они могут быть пропущены или сильно недопредставлены.

В последнее время извлечение ДНК сообществ из образцов почвенных бактерий позволило получить более полный отбор проб бактериальных сообществ. Считается, что этот подход, не основанный на культуре, более репрезентативен для реальных сообществ, чем традиционные методы, основанные на культуре.

В этом видео будет продемонстрирован некультуральный метод экстракции ДНК бактериального сообщества, как проверить качество и количество извлеченной ДНК, а также рассмотреть, как эта ДНК может быть использована для изучения бактериального разнообразия.

Извлечение ДНК из почвы может быть проведено одним из двух способов. При использовании метода фракционирования клетки сначала отделяются от матрицы почвы перед извлечением генетического материала. Затем образец подвергают последовательным циклам смешивания и медленного центрифугирования для сбора неповрежденных клеток в гранулу.

Затем к клеткам добавляют лизоцимы, и суспензию инкубируют. Лизоцимы – это ферменты, которые разрушают клеточные стенки бактерий. После того, как структура клеточной стенки была нарушена, ДНК может быть высвобождена для очистки. Тем не менее, было показано, что второй метод экстракции ДНК в сообществе, метод in situ, дает большую концентрацию ДНК.

Здесь масса почвы соединяется с эквивалентным объемом экстракционного буфера Tris-EDTA и стеклянных шариков и агрессивно перемешивается, чтобы облегчить отделение клеток от частиц почвы. Затем добавляют детергентное средство, как правило, додецилсульфат натрия или SDS, и образец дополнительно смешивают, чтобы способствовать лизингу клеток и высвобождению их содержимого, включая ДНК.

Затем проводится инкубация при высокой температуре для лизирования любых оставшихся бактериальных клеток. Образцы центрифугируют, а также проводят экстракцию полиэтиленгликолем и инкубацию надосадочной жидкости с целью осаждения ДНК, которая затем центрифугируется в гранулы.

ДНК ресуспендируется в TE Buffer и ацетате калия с целью дальнейшего вымывания ДНК из белков и полисахаридов, затем проводится центрифугирование для гранулирования этих нежелательных компонентов. Водный надосадочный агент, содержащий ДНК, удаляют и подвергают фенол-хлороформной экстракции и осаждению изопропанола для дальнейшей очистки и концентрации ДНК. После инкубации при комнатной температуре продолжительностью два часа ДНК центрифугируют и ресуспендируют в TE-буфере для хранения до анализа.

Теперь, когда мы знакомы с концепциями и процессами, лежащими в основе экстракции ДНК бактериального сообщества, давайте рассмотрим, как она проводится в лаборатории.

Для начала процедуры отвесьте 100 г просеянного грунта. Добавьте его в полипропиленовый сосуд и добавьте 100 мл экстракционного буфера, состоящего из трис-буфера, обработанного ЭДТА для стимулирования высвобождения бактерий из почвенного матрикса, затем встряхните вручную.

Далее взвесьте 100 г стеклянных шариков и добавьте их в емкость для смешивания. Взбалтывайте образец в течение 5 минут с помощью устройства для взбивания бусин или механического встряхивателя на запястье. Добавьте в смесь 10 мл 20% додецилсульфата натрия, или SDS, затем перемешайте еще минуту. Инкубировать при высокой температуре в течение 60 мин.

Равномерно распределите образец по отдельным пробиркам объемом 50 мл и центрифугируйте в течение 10 мин при 6 000 x г. Переложите надосадочную жидкость из пробирок в один стерильный контейнер. Далее повторите экстракцию на почвенной грануле, как описано ранее, используя свежий объем буфера для экстракции.

Далее добавьте общий объем переработанной надосадочной жидкости в чистую 50-мл пробирку, заполненную наполовину раствором 30% полиэтиленгликоля и 1,6 М натрия хлорида. Переверните бутылки несколько раз вручную, чтобы перемешать, и выдержите при комнатной температуре в течение 2 часов. Центрифугируйте образцы при давлении 10 000 x g в течение 20 минут, чтобы гранулировать ДНК.

Осторожно удалите надосадочную жидкость из пробирки центрифуги, оставив после себя частично очищенную гранулу нуклеиновой кислоты. Добавьте 20 мл TE Buffer и 1,5 мл 7,5 М раствора ацетата калия для ресуспендирования гранулы, затем вортекс. Поместите суспензию на лед на 5 минут. Центрифуга при 16 000 x g в течение 30 мин при 4 ? C для осаждения белков и полисахаридов.

Затем добавьте в образец РНКазу и протеиназу К, аккуратно перемешайте вручную и оставьте на некоторое время. Добавьте эквивалентный объем фенола:хлороформа:изоамилового спирта в экстрагируемую суспензию и аккуратно перемешайте вручную. Центрифугируйте препарат в течение 10 минут при 13 000 x g. Осторожно извлеките сосуд из центрифуги, и обратите внимание на два слоя.

Нижний, более тяжелый слой состоит из фенола:хлороформа:изоамилового спирта и экстрагированного мусора, а верхний слой является водным и содержит ДНК. Поместите водную фазу в стерильный сосуд, добавьте эквивалентный объем изопропанола и осторожно переверните, чтобы инициировать осаждение ДНК. Выдерживать суспензию при комнатной температуре в течение 2 ч. Гранулируйте очищенную ДНК центрифугированием при концентрации 16 000 x g в течение 30 минут. Осторожно удалите надосадочную жидкость, так как гранулированная ДНК может быть видна или не видна на дне сосуда, а затем повторно суспендируйте в 1 мл TE Buffer.

С помощью спектрофотометра или флуориметра количественного определения ДНК/РНК измерьте уровень ДНК, извлеченной из образца. Флуориметры ДНК/РНК будут выводить уровни ДНК в нанограммах на миллилитр. Если концентрация слишком высока для точных показаний, разбавьте суспензию в соотношении 1:10 или в соотношении 1:100 с помощью молекулярной воды.

После того, как ДНК получена из бактериального сообщества, она может быть использована различными способами. Некоторые из этих применений рассматриваются здесь.

Спектрофотографический анализ ДНК, выделенной из ДНК сообщества, может дать представление о количестве бактериальных клеток, присутствующих в данном образце почвы. Расчетное количество ДНК в нг на мл раствора может быть соотнесено с общим объемом ДНК, экстрагированной в растворе, чтобы получить общее количество ДНК на г почвы. Зная теоретическую ценность ДНК на клетку, можно рассчитать общее количество клеток на г почвы.

Для более целенаправленных применений ДНК, извлеченную из бактериальных сообществ, можно подвергнуть ПЦР, чтобы определить, присутствует ли конкретный вид в сообществе. Например, ученые могут захотеть определить, содержат ли образцы почвы конкретные патогены, такие как Clostridium perfringens или Bacillus anthracis.

Наконец, чтобы получить более полное представление о бактериях, присутствующих в сообществе, образцы ДНК могут быть подвергнуты «омической» и биоинформатической характеристике, что позволяет провести более глубокий анализ исходных бактерий в образце. ? Омикс? описывает ряд технологий, которые исследуют роли, взаимоотношения и действия молекул в организмах или сообществах. Это включает в себя изучение генов и их функций, или ? Геномика?, и ? Протеомика?, изучение белков и их роли. Например, секвенирование 16S? РНК из образцов может позволить метагеномное определение конкретных видов в сообществе, давая более подробную оценку разнообразия. Такой подход может дать ученым лучшее понимание видового состава сообщества и того, какие роли они могут выполнять.

Вы только что посмотрели введение JoVE в экстракцию ДНК бактериальных сообществ. Теперь вы должны понять, как извлечь ДНК из бактериального сообщества, как проверить качество этой ДНК и как эта ДНК может быть использована для исследования состава бактериального сообщества. Спасибо за просмотр!