Нерадиоактивные На месте Гибридизация Протокола, применяемыми для Норвегии ель и диапазон видов растений
17 апреля 2009 г.
Мы описываем изменение DIG На месте Гибридизации протокол, который быстро и применимыми на широкий спектр видов растений, включая Норвегию ели. С помощью всего лишь несколько корректировок, в том числе изменен РНКазы лечения и протеиназы К концентрация, протокол может быть использован в исследованиях различных тканей и видов.
Протокол нерадиоактивной гибридизации in situ, применимый для ели обыкновенной и ряда других видов растений. Карре и др. Здравствуйте, меня зовут АМ Ган, мы работаем в университете OBS и Шведском университете сельскохозяйственных наук в г. Обс, Швеция.
Мы разработали протокол посещения насекомыми цветков, который применим к нескольким различным видам растений. Сегодня мы продемонстрируем несколько трудоемких этапов. В рамках данного протокола мы покажем процесс заливки и изготовления срезов, а также различные этапы проведения самого эксперимента по посещению цветков.
Перейдем в лабораторию один, этапы фиксации и заливки с девятого по одиннадцатый согласно протоколу. Шаг 9: предварительно прогрейте чашки Петри и формы при 60 °C. Шаг 10: нагрейте пинцет и равномерно распределите ткани в чашке.
Добавьте больше гистологического воска, чтобы ткани были полностью покрыты. На шаге 11 дайте воску затвердеть при комнатной температуре. Выполните шаги с 12 по 19 протокола.
Включите нагревательные плитки и подготовьте расплавленный гистологический воск. Достаньте образцы из холодильной комнаты. На шаге 13 с помощью скальпеля аккуратно вырежьте блок ткани в воске.
Придайте образцу форму, удобную для нарезки. На шаге 14 нагрейте блок и основание, затем соедините их. Оставьте препарат затвердевать при температуре 4 °C.
На шаге 15 разрежьте восковой блок на срезы толщиной от шести до восьми микрометров. С помощью микротома срезы объединяются в одну длинную ленту. Отрежьте ленту и перенесите ее на бумагу.
На данном этапе можно осмотреть отдельные срезы под стереомикроскопом, чтобы выбрать интересующие области. Провести такой осмотр будет проще, если ткани окрашены эозином. Шаг 17: добавьте безРНК-ную воду Milli Q на предметные стекла.
Разрежьте ленту на более мелкие фрагменты и поместите их на предметные стекла. Перенесите стекла на нагревательную плитку. Шаг 17: дайте лентам распластаться на плитке с температурой 42 °C в течение одной-двух минут.
Удалите воду с помощью салфеток Kimwipe. Шаг 19: инкубируйте стекла при 42 °C в течение ночи, чтобы ткани закрепились на стеклах для гибридизации in situ 4.1 в разделе «Предварительная обработка срезов для гибридизации in situ», шаги с 36 по 48 протокола.
Шаг 36: депарафинизация срезов в гистологическом слое. Слайды располагают на равном расстоянии друг от друга и помещают в кассету для удобства перемещения между различными контейнерами, затем обезвоживают срезы. В серии этанола добавляют уксусный ангидрид при интенсивном перемешивании.
Шаг 45, подготовка к обработке уксусным ангидридом 4.2 гибридизация in situ. Шаги с 49 по 52 в протоколе. Шаг 51, выдержка предметных стекол Pro One Plus.
Раствор вязкий. Старайтесь избегать образования пузырьков. Инкубируйте предметные стекла в увлажненной камере.
4.3 инициализация. После гибридизации выполните шаги с 53 по 72 протокола. На шаге 62 инкубируйте предметные стекла с буферным блоком в пластиковом контейнере.
Шаг 63: добавьте достаточное количество блокирующего раствора, чтобы полностью покрыть предметные стекла. Антитела наносятся на стекла с помощью метода «старения» (aging). Этот метод применим только к стеклам Prob Bon Plus. Для стекол аналогичной конструкции на шаге 65 позвольте капиллярным силам втянуть раствор антител anti-dig.
Этот этап повторяют. Повторите шаг 70, как и прежде: нанесите раствор Western Blue методом «сэндвича» и втяните его. Обратите внимание, что раствор Western Blue втягивают дважды, точно так же, как мы делали с раствором анти-DIG антител.
На шаге 65 и шаге 71 инкубируйте стекла в темноте от одного до пяти дней при комнатной температуре; мониторинг сигналов гибридизации можно осуществлять с помощью стереомикроскопа. Пока стекла находятся в сэндвиче, должны быть заметны окрашивания от пурпурного до коричневого цвета.
Так выглядят результаты фактического эксперимента на станции CW. Здесь сигнал виден в виде пурпурного или коричневатого окрашивания.
Обзор
В данной статье представлен модифицированный протокол гибридизации in situ с использованием DIG, который является эффективным и адаптируемым для различных видов растений, включая ель обыкновенную. Протокол включает определенные корректировки, такие как изменения в обработке РНказой и концентрации протеиназы K, для повышения его применимости к различным тканям и видам.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология растений
- Молекулярная биология
- Методы гибридизации in situ
Теоретические сведения
- Гибридизация in situ является ценным методом изучения экспрессии генов в тканях.
- Традиционные методы могут быть трудоемкими и специфичными для конкретных видов.
- Модификации существующих протоколов позволяют повысить эффективность и универсальность метода.
- Данное исследование сосредоточено на протоколе, подходящем для ряда видов растений.
Цель исследования
- Разработать более быстрый и адаптивный протокол гибридизации in situ.
- Продемонстрировать применимость данного протокола для ели обыкновенной и других видов растений.
- Предоставить исследователям подробное описание этапов процедуры.
Используемые методы
- Заливка и срезание тканей растений.
- Этапы предварительной обработки и гибридизации для анализа in situ.
- Использование специфических реагентов и условий для оптимизации результатов.
- Мониторинг сигналов гибридизации под микроскопом.
Основные результаты
- Модифицированный протокол успешно позволяет проводить гибридизацию in situ для множества видов растений.
- Корректировка обработки РНказой и концентрации протеиназы K улучшает совместимость с тканями.
- Была достигнута четкая визуализация сигналов гибридизации.
- Протокол эффективен и воспроизводим для различных применений.
Выводы
- Модифицированный протокол гибридизации in situ с использованием DIG является ценным инструментом для исследований растений.
- Он позволяет проводить быстрый и эффективный анализ экспрессии генов в различных тканях растений.
- Будущие исследования могут основываться на данном протоколе для более широкого применения в биологии растений.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол позволяет проводить пространственный анализ экспрессии генов с высоким разрешением в растительных системах, что способствует валидации мишеней на ранних этапах поиска путем подтверждения тканеспецифических паттернов экспрессии. Он снижает зависимость от радиоизотопов и необходимости глубокой оптимизации для каждого конкретного вида, повышая воспроизводимость и масштабируемость сравнительных исследований между видами. Метод обеспечивает снижение механистических рисков при фенотипическом скрининге и поиске трансляционных биомаркеров в биофармацевтических разработках на основе растений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: Подтверждает тканеспецифичную локализацию мРНК для проверки терапевтических гипотез и уточнения функций генов в путях репродуктивного развития.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством прямой визуализации экспрессии генов в мужских репродуктивных органах моделей голосеменных и покрытосеменных растений.
- Прогностическая ценность: Повышает достоверность прогнозов, демонстрируя консервативные паттерны экспрессии гомологичных генов (например, гомологов AP3) в структурах цветков Arabidopsis, Brassica и ели обыкновенной.
Скрининг и разработка методов анализа
- Готовность к анализу: Подготовка стандартизированных срезов тканей для последующих анализов гибридизации с обеспечением стабильного детектирования сигнала с использованием DIG-меченных зондов.
- Воспроизводимость: Исключение обработки РНказой и корректировка концентрации протеиназы K для усиления сигнала и снижения вариабельности между различными видами.
- Масштабируемость: Облегчение высокопроизводительного применения для различных видов растений с минимальными корректировками протокола, что позволяет повторно использовать платформу в сравнительной геномике.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: демонстрирует применимость метода от модельных покрытосеменных к голосеменным растениям, что позволяет экстраполировать полученные данные на древесные многолетние системы, значимые для производства биомассы и биополимеров.
- Механистическое снижение рисков: уменьшает неопределенность при определении функций генов, связывая гомологию последовательностей с пространственной экспрессией в консервативных структурах развития.
- Сопоставление биомаркеров: обеспечивает пространственную корреляцию экспрессии генов с фенотипическими признаками в репродуктивных тканях, что способствует поиску биомаркеров в молекулярном растениеводстве.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод относится к фазе поисковой биологии, позволяя осуществлять идентификацию мишеней на основе выдвинутых гипотез перед скринингом ведущих соединений в экспрессионных системах на основе растений.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез путем подтверждения пространственной экспрессии генов-кандидатов в конкретных тканях и на определенных стадиях развития.
- Скрининг: Позволяет получать количественные данные о пространственной локализации, которые используются при разработке методов мониторинга эффекта соединений в трансгенных или обработанных тканях.
- Аналитика: Обеспечивает получение детектируемых хромогенных сигналов (от пурпурного до коричневатого), пригодных для визуализации и сравнительного анализа в различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: Устанавливают связь между паттернами экспрессии генов и фенотипами развития репродуктивных органов, что помогает принимать решения о продвижении по этапам валидации признаков.
- Корпоративное повторное использование: Создает стандартизированный, адаптируемый рабочий процесс для анализа экспрессии генов у разных видов, сокращая затраты на повторную оптимизацию.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность валидации мишени за счет прямого пространственно-разрешенного детектирования мРНК без использования радиоактивных веществ.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость за счет исключения обработки РНказой и стандартизации использования протеиназы K, что снижает частоту неудач при выполнении протокола.
- Стратегическая ценность: ускоряет принятие решений о целесообразности (go/no-go) при выборе мишени, предоставляя однозначные данные об экспрессии на ранних этапах поиска.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию мишеней с поправкой на риск на основе консервативных паттернов экспрессии у разных видов, повышая вероятность успеха в последующих приложениях.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области гистологии, заливки тканей в парафин и изготовления срезов растительных материалов.
- Зависит от наличия микротомов, печей для гибридизации и систем хромогенного детектирования.
- Необходимо стандартизировать концентрацию протеиназы K в зависимости от плотности ткани и содержания фенольных соединений.
- Потребуется адаптация времени и температуры инкубации для различных видов растений и разной длины зондов.
- Возможны ограничения, связанные с автофлуоресценцией тканей и проникновением соединений в образцы с высокой степенью лигнификации или высоким содержанием вторичных метаболитов.
