Multi-Параметрический Островок Perifusion системы в микрожидкостных устройств Perifusion

В этой презентации мы представим микрофлюидную систему перфузии век для одновременного измерения динамической секреции инсулина, притока кальция и изменений митохондриального потенциала глазков поджелудочной железы в ответ на секрецию инсулина собаками. Перфузионная система состоит из трехслойного микрофлюидного устройства, шприцевых насосов и фракционного коллектора инсулина. Индуцированный секрецией приток кальция и митохондриальные потенциалы визуализируются с помощью флуоресцентного микроскопа.

Здравствуйте, меня зовут Ола, я работаю в лаборатории доктора Вэла Холтера на кафедре трансплантационной хирургии Университета Иллинойса в Чикаго. Привет, я Дон Ли, тоже из лаборатории October's Lab. Привет, я Триша Харт, тоже из лаборатории Dr.Al Holster.

Сегодня мы покажем вам процедуру одновременной визуализации век с использованием линейного градиента глюкозы. Мы использовали эту процедуру в нашей лаборатории для изучения визуального образа и функции глаз. Итак, приступим.

Микрофлюидное устройство, используемое для этой процедуры, собирается из трех слоев отвержденного PDMS, полученного с помощью стандартной фотолитографии. Первый слой, созданный из силиконового мастера, содержит отверстия микрофлюидного устройства, которое будет мягко удерживать проушины на месте, глубиной 150 микрометров и диаметром 500 микрометров. Второй слой имеет каналы высотой 500 микрометров и шириной два миллиметра.

Середина канала расширяется для распределения потока для лучшего обмена раствора Внутри устройства, в обменный колодец делается путем пробивания отверстия высотой три миллиметра и шириной семь миллиметров в середине слоя. Третий слой представляет собой толстую плиту PDMS. Чтобы приготовить этот слой, проделайте небольшие отверстия с обеих сторон, которые совпадают с входом и выходом канала.

На втором слое, после того как все три слоя созданы, первый слой приклеивается к предметному стеклу отверстиями вверх. Затем второй слой приклеивается к первому слою с расстоянием между каналами. Наконец, третий слой приклеивается ко второму слою.

После того, как слои склеены, устройство готово к использованию для экспериментов. С помощью шприца объемом 10 миллилитров, заполненного 70% этанолом и подключенного к входному порту устройства с помощью Tai на трубке, простерилизуйте микрофлюидное устройство, пропуская этанол через каналы устройства. Затем с помощью того же установочного потока деионизированная вода вымывает этанол.

После того, как устройство будет стерилизовано, поместите его на нагретый предметный столик микроскопа с помощью тигональной трубки, подключите шприцевые насосы, содержащие растворы с высоким и низким содержанием глюкозы, к Y-образному разъему. Затем подключите к входному отверстию микрофлюидного устройства. Подсоедините выходное отверстие микрофлюидного устройства к коллектору фракций.

Убедитесь, что трубка опирается на нагревательную пластину с температурой 37 градусов Цельсия. Очень важно поддерживать физиологическую температуру растворов на протяжении всего эксперимента. Затем используйте программу лабораторного просмотра для запуска градиента глюкозы, который будет перфузироваться через микрофлюидную сеть во время эксперимента.

Это программное обеспечение изменяет скорость потока двух растворов глюкозы. Управляя шприцевыми насосами, здесь можно создавать различные профили градиента глюкозы, линейные, колоколообразные и квадратные профили градиента глюкозы. По сравнению с расчетными ожидаемыми значениями, показанными в данном эксперименте, будет использоваться линейный градиент от двух миллимоляров до 25 миллимоляров глюкозы с изменяющейся скоростью потока 0,01 миллилитров в минуту двух растворов глюкозы и постоянной скоростью потока 0,25 миллилитров в минуту, поступающей в устройство после смешивания растворов.

После выбора подходящего профиля градиента проверьте его стабильность. Во-первых, запустите градиентную систему. Затем запускают фракционный коллектор и собирают перфузу восьми в один миллилитр в конце пробирки.

Затем с помощью глюкометра проверьте концентрацию глюкозы в каждой пробирке с помощью excel. Проанализируйте результаты, полученные с помощью глюкометра. Далее замените шприц с высоким содержанием глюкозы на шприц, содержащий 0,5% раствор БСА в буфере Krebs ringer PERFUSE 50 миллилитров через прибор со скоростью один миллилитр в минуту.

Это предотвратит неспецифическую абсорбцию инсулина к стенкам микроканала, что обеспечит точность при последующем измерении уровня секретируемого инсулина после перфузии с БСА. Замените его раствором с высоким содержанием глюкозы reus. Суспензируйте от 25 до 30 отобранных вручную мышиных глазков в двухмолярном буфере Krebs Ringer с двумя молярами, содержащем индикаторный краситель кальция fira 2:00 AM и индикаторный краситель митохондриальных потенциалов rumine 1 2 3, инкубируйте в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.

После инкубации отсоедините устройство от системы перфузии и осторожно загрузите проушины в микрофлюидное устройство, вставив наконечник пипетки, содержащей островки, во входной порт, и медленно дозируя островки после загрузки, снова подключите устройство к системе перфузии. Соблюдайте осторожность и не вводите пузырьки. Затем запустите шприцевой насос, чтобы начать перфузию глазков KRB, содержащим два миллимоляра глюкозы.

На этом этапе излишки красителя будут смыты со среды, назначены комплекты фильтров возбуждения и излучения, а также время воздействия, которое будет использоваться во время эксперимента. Затем установите сборщик фракций на сбор с интервалом в одну минуту, используя проушины с раствором с низким содержанием глюкозы. Используйте инструмент «Область интереса» или «Окупаемость инвестиций» из простого программного обеспечения для обработки изображений PCI, чтобы определить области или люверсы, которые вы хотите визуализировать.

Кроме того, обведите областью фона, которая будет вычтена после того, как клетки будут промыты в течение 10 минут, запустите коллектор градиентных фракций глюкозы и запустите покадровую съемку. Через 30 минут выключите программное обеспечение и шприцевую помпу с высоким содержанием глюкозы. Продолжайте перфузию с низким уровнем глюкозы, чтобы смыть эффект высокого уровня глюкозы.

Через 10 минут остановите поступление низкого уровня глюкозы, выключив шприцевую помпу. После перфузии экспортируйте данные в Excel для анализа. Количество инсулина, выделяемого в perfu eight, может быть определено с помощью глазков мышей ELA.

Были перфузированы с линейным градиентом от двух до 25 миллимолярных глюкоз, как показано здесь. Приток кальция и секреция инсулина запускаются примерно через 13 минут перфузии, что соответствует шести миллимолярам. Глюкоза. Изменения в митохондриальных потенциалах наблюдаются раньше, как и ожидалось, примерно через 11 минут.

Эти данные демонстрируют преимущество использования этой микрофлюидной сети для характеристики физиологии глазков. Мы только что показали вам, как использовать наше микрофлюидное устройство для пара-слияния для изучения физиологии глазных вставок. При выполнении этой процедуры важно не забывать следить за тем, чтобы в устройстве не было пузырьков, так как это может привести к смещению глазков во время эксперимента.

Кроме того, шлейф можно регулировать до одного мл в минуту, не нарушая люверсы. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.