Multi-Параметрический Островок Perifusion системы в микрожидкостных устройств Perifusion

В данной презентации мы представим микрофлюидную систему перфузии островков, предназначенную для одновременного измерения динамики секреции инсулина, притока ионов кальция и изменений митохондриального потенциала островков Лангерганса под воздействием секретагогов инсулина. Система перфузии состоит из трехслойного микрофлюидного устройства, шприцевых насосов и фракционного коллектора. Приток кальция и митохондриальный потенциал, индуцированные секретагогами инсулина, визуализируются с помощью установки с флуоресцентным микроскопом.

Здравствуйте, меня зовут Ола, я сотрудник лаборатории доктора Вал Холтера на кафедре трансплантационной хирургии Иллинойсского университета в Чикаго. Здравствуйте, я Дон Ли, также из лаборатории доктора Холтера. Здравствуйте, я Триша Харт, также из лаборатории доктора Холтера.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру одновременной визуализации века с использованием линейного градиента глюкозы. Мы применяли эту методику в нашей лаборатории для изучения визуальных характеристик и функций века. Итак, приступим.

Микрофлюидное устройство, используемое в данной процедуре, состоит из трех слоев отвержденного ПДМС, изготовленных методом стандартной фотолитографии. Первый слой, полученный с помощью силиконовой формы, содержит лунки микрофлюидного устройства, которые будут надежно фиксировать глазки; глубина лунок составляет 150 micrometers, а диаметр — 500 micrometers. Второй слой содержит каналы высотой 500 micrometers и шириной two millimeters.

Средняя часть канала расширена для распределения потока с целью улучшения обмена раствором. Внутри устройства в обменном окне пробивается отверстие высотой 3 mm и шириной 7 mm в центре слоя. Третьим слоем является толстая пластина PDMS. Для подготовки этого слоя пробейте с обеих сторон небольшие отверстия, которые совпадают с входом и выходом канала.

После создания всех трех слоев первый слой приклеивают к предметному стеклу лунками вверх. Затем второй слой приклеивают к первому слоем с каналами вверх. Наконец, третий слой приклеивают ко второму.

После склеивания слоев устройство готово к использованию в экспериментах. Используя шприц объемом 10 milliliter, заполненный 70% ethanol и подключенный к входному порту устройства с помощью трубки Tai, стерилизуйте микрофлюидное устройство, пропуская ethanol через каналы устройства. Затем, используя ту же установку, пропустите деионизированную воду, чтобы вымыть ethanol.

После стерилизации устройства поместите его на подогреваемый предметный столик микроскопа с помощью трубок Tigon, подключите шприцевые насосы с растворами глюкозы высокой и низкой концентрации к Y-образному соединителю. Затем подключите их к входному отверстию микрофлюидного устройства. Выходное отверстие микрофлюидного устройства подключите к фракционному коллектору.

Убедитесь, что трубки расположены на нагревательном планшете при температуре 37 °C. Крайне важно поддерживать физиологическую температуру растворов на протяжении всего эксперимента. Затем с помощью программы LabVIEW инициируйте создание градиента глюкозы, который будет перфузироваться через микрофлюидную сеть во время эксперимента.

Данное программное обеспечение изменяет скорость потока двух растворов глюкозы. Путем управления шприцевыми насосами здесь можно создавать различные профили градиента глюкозы: линейный, колоколообразный и прямоугольный. В данном эксперименте представлены результаты в сравнении с расчетными ожидаемыми значениями; при этом будет использоваться линейный градиент глюкозы от 2 mM до 25 mM с варьируемой скоростью потока двух растворов глюкозы 0,01 mL/min и постоянной скоростью потока 0,25 mL/min при поступлении смеси растворов в устройство.

После выбора подходящего профиля градиента проверьте стабильность градиента. Сначала запустите систему градиента. Затем запустите фракционный коллектор и соберите восемь фракций по 1 ml в пробирки типа Eppendorf.

Затем с помощью глюкометра измерьте концентрацию глюкозы в каждой пробирке и внесите данные в excel. Проанализируйте результаты, полученные с глюкометра. Далее замените шприц с раствором высокой концентрации глюкозы шприцем, содержащим 0,5% BSA в буфере Кребса-Рингера, и ПЕРФУЗИРУЙТЕ 50 milliliters через устройство со скоростью 1 milliliter в минуту.

Это предотвратит неспецифическую абсорбцию инсулина стенками микроканала для обеспечения точности последующего измерения уровней секретируемого инсулина после перфузии BSA. Замените его раствором с высоким содержанием глюкозы reus. Суспендируйте 25–30 отобранных вручную островков поджелудочной железы мыши в буфере Кребса-Рингера с 2 мМ глюкозы, содержащем краситель-индикатор кальция fira 2:00 AM и краситель-индикатор митохондриального потенциала rumine 1 2 3, и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.

После инкубации отсоедините устройство от перфузионной системы и осторожно перенесите островков в микрофлюидное устройство, введя наконечник пипетки с островками в inlet port; после распределения островков снова подключите устройство к перфузионной системе. Соблюдайте осторожность, чтобы не допустить попадания пузырьков воздуха. Затем запустите шприцевой насос, чтобы начать перфузию островков буфером KRB, содержащим 2 mM глюкозы.

На данном этапе необходимо вымыть избыток красителя из среды, определить наборы фильтров возбуждения и эмиссии, а также время экспозиции, которые будут использоваться в ходе эксперимента. Затем настройте фракционный коллектор на сбор проб с интервалом в одну минуту, параллельно используя люверсы с раствором с низким содержанием глюкозы. Используйте инструмент определения области интереса (ROI) в программном обеспечении для PCI-визуализации, чтобы обозначить области или люверсы, которые необходимо визуализировать.

Также обведите область фона, которая будет вычтена после 10-минутного промывания клеток, запустите фракционный коллектор градиента глюкозы и начните таймлапс-визуализацию. Через 30 минут выключите программное обеспечение и шприцевой насос с высокой концентрацией глюкозы. Продолжайте перфузию с низкой концентрацией глюкозы, чтобы вымыть эффект высокой концентрации глюкозы.

Через 10 минут остановите поток раствора с низким содержанием глюкозы, выключив шприцевой насос. После завершения перфузии экспортируйте данные в Excel для анализа. Количество инсулина, секретированного в перфузат, можно определить с помощью ELISA для островков Лангерганса мыши.

Проводили перфузию с линейным градиентом глюкозы от 2 до 25 мМ, как показано здесь. Приток кальция и секреция инсулина запускаются примерно через 13 минут перфузии, что соответствует концентрации глюкозы 6 мМ. Изменения митохондриальных потенциалов, как и ожидалось, наблюдаются раньше, примерно через 11 минут.

Эти данные демонстрируют преимущество использования данной микрофлюидной сети для характеристики физиологии глазков. Мы только что показали вам, как использовать наше микрофлюидное устройство для парафузии при изучении физиологии глазков. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости убедиться в отсутствии пузырьков воздуха в устройстве, так как это может привести к смещению глазков во время эксперимента.

Кроме того, скорость потока можно увеличить до 1 ml в минуту, не смещая глазки. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в проведении вашего эксперимента.