June 22nd, 2012
Метод культуре эндотелиальных монослоя клетки по всему внутреннему 3D поверхность микрофлюидных устройство с микрососудистой размеров каналов (<30 мкм) описывается. Это В пробирке Микрососудов модель позволяет изучать биофизические взаимодействия между клетками крови, эндотелиальных клеток и растворимых факторов, в гематологических заболеваний.
Общая цель этой процедуры заключается в создании микрофлюидного устройства, покрытого эндотелиальными клетками. Это достигается путем предварительного изготовления микрофлюидной формы. Второй шаг — создание канала PDMS.
Далее эндотелиальные клетки засеваются в устройство. Последним этапом является культивирование клеток внутри устройства. В конечном счете, микрофлюидные устройства, покрытые эндотелиальными клетками, используются для демонстрации межклеточных взаимодействий in vitro.
Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что она обеспечивает исследователю жесткий контроль над биологическими и биофизическими условиями и совместима с флуоресцентной микроскопией. Хотя этот метод может дать представление о биофизических клеточных взаимодействиях клеток при гематологических заболеваниях, он также может быть применен к таким явлениям, как биология лейкоцитов, метастазирование рака и биология гемопоэтических стволовых клеток. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что условия должны быть жестко контролируемыми для успешного сидения в клетке.
При подготовке к изготовлению создается фотошаблон путем отправки компьютерного изображения устройства Microfluid стороннему поставщику масок. После получения маска состоит из слоя хрома на натриевом известковом стекле. Здесь ширина микрофлюидного канала составляет 30 мкм.
Чтобы начать изготовление микрофлюидного устройства, очистите голую силиконовую пластину пираньей в течение 15 минут, а затем промойте деионизированной водой в течение 10 секунд. Затем погрузите силиконовую пластину в фтористоводородную кислоту на 30 секунд и промойте деионизированной водой в течение примерно 10 секунд. Далее с помощью спин-котера Spin micro chem SU 8 20 25 фоторезист наносят на пластину на высоту до 30 мкм с использованием скорости отжима 3000 оборотов в минуту.
Поместите пластину с покрытием SU 8 20 25 на горячую плиту с температурой 95 градусов Цельсия на пять минут, чтобы удалить излишки растворителя. Для этого шага не рекомендуется использовать духовку. Теперь поместите фотомаску на пластину и подвергните воздействию ультрафиолетового света в подложке маски, чтобы сшить фоторезист SU 8 20 25.
После сшивания поместите пластину обратно на горячую плиту при температуре 95 градусов Цельсия еще на пять минут. Для дальнейшего ускорения полимеризации СУ 8, 20, 25 фоторезист. Затем погрузите пластину в проявитель SU eight, который состоит преимущественно из P-G-M-E-A на четыре минуты.
Это удалит несшитую фотографию SU 8 20 25. Сопротивляться. Промойте новую пластину 100% изопропиловым спиртом в течение 10 секунд, затем высушите с помощью азота под давлением или дав растворителю испариться из пластины в чистом вытяжном шкафу в течение нескольких минут. Теперь прикрепите высушенную к центру чашки Петри, осторожно размещая ленту по краям.
Наконец, нанесите пипеткой 500 микролитров сигма-слоя на пластину. Накройте чашку Петри крышкой, а затем поверните чашку, чтобы обеспечить полное покрытие. Снимите крышку и дайте вафле высохнуть в течение нескольких минут, пока весь растворитель не испарится.
После смешивания полимера PDMS и отвердителя в соотношении 10 к одному весу к весу удалите пузырьки воздуха с помощью вакуумного осушителя в течение от нескольких минут до одного часа, в зависимости от мощности имеющейся вакуумной системы. После того как все пузырьки воздуха будут удалены, вылейте смесь в посуду так, чтобы вафля и поверхность посуды были покрыты. Для создания листа ПДМС толщиной примерно пять миллиметров.
Также создадим тонкий безликий кусок PDMS толщиной в один миллиметр. Затем засушите смесь в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день с помощью ножа или скальпеля разрежьте вокруг пластины и удалите несколько микрофлюидных устройств PDMS.
Затем разрежьте лист, чтобы изолировать отдельные устройства. Отрежьте лист PDMS немного большего размера, чем микрофлюидное устройство. Теперь используйте штифтовые тиски Harris unicorn или аналогичное устройство для создания входных и выходных отверстий в микрофлюидном устройстве.
Далее зачистите поверхности микрофлюидного устройства и листа с помощью скотча. Затем с помощью плазменного очистителя поверхность микрофлюидного устройства и листа PDMS подвергается воздействию кислородной плазмы в течение 30 секунд. Кислородная плазма создает реактивные вещества на открытой поверхности PDMS, которые связываются при физическом контакте.
Затем наполните одномиллилитровый шприц, оснащенный тупой иглой 20 калибра, 50 микрограммами на миллилитр. Фибронектин из плазмы крови человека в PBS затем помещается длиной трубки над иглой. Вставьте кусок более тонкой трубки в первый кусок трубки, чтобы создать трение между двумя частями трубки.
Затем присоедините другой конец более тонкого куска трубки к входу микрофлюидного устройства. Надавите на шприц, чтобы полностью заполнить каналы раствором фибронектина и создать небольшую каплю в 100 микролитров в смотровом порту, чтобы каналы оставались влажными. Теперь инкубируйте микрофлюидное устройство во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 40–60 минут.
После инкубации подсоедините свежий шприц, наполненный PBS, к игле с тупым концом. Приложите давление, чтобы промыть микрофлюидное устройство PBS. Подготовьте от 500 000 до 2 миллионов клеток на миллилитр эндотелиальных клеток пупочной вены человека или принимайте в эндотелиальной питательной среде 8% декстрана.
Добавление декстрана увеличивает вероятность того, что клетки прилипнут и успешно культивируются в микрофлюидном устройстве. Наполнитель чистого шприца снабжен тупым концом иглы и более широкой трубкой с клеточной подвеской и соединен более длинной трубкой длиной примерно один метр в длину. Очень важно убедиться, что трубка плотно прилегает, чтобы исключить утечку между любыми соединениями.
Загрунтуйте трубку раствором для ячеек, убедившись, что ни в шприце, ни в трубке нет пузырьков. На этом этапе крайне важно предотвратить попадание в систему утечек или пузырей. Любая утечка раствора или наличие пузырьков в среде будет препятствовать успешному сидению эндотелиальных клеток.
После того, как все пузырьки будут удалены и трубка по всей длине будет заполнена клеточной суспензией, поместите шприц на насос и присоедините другой конец к входному отверстию микрофлюидной жидкости. Шприцевой насос установлен на той же высоте, что и микрофлюидное устройство. Большая длина трубки тщательно скручивается внутри инкубатора, чтобы обеспечить достаточный нагрев клеток и среды перед контактом с устройством.
Затем клеточная суспензия вводится в микрофлюидное устройство со скоростью объемного потока 1,23 микролитра в минуту в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в нашей системе. Объемная скорость гриппа в 1,23 микролитра в минуту соответствует скорости среднего потока в один миллиметр в секунду в самых маленьких каналах. Это приблизительное напряжение сдвига стенки в один цент на квадратный сантиметр в этих каналах при использовании цельной крови.
После завершения инфузии клеточной суспензии используйте тот же шприц-насос и длинную трубку со шприцем большего размера, чтобы вводить свежую питательную среду в течение двух-восьми дней со скоростью 1,23 микролитра в минуту. Когда монослой клеток находится на нужном уровне слияния, введите в систему кровь или клеточную суспензию для экспериментов. Здесь показано микрофлюидное устройство перед эндотелизацией.
Микрофлюидное устройство было наполнено пищевым красителем, чтобы проиллюстрировать размер, масштаб и общую конструкцию устройства, которая имитирует физиологию сосудистой сети. Светлопольная микроскопия выявляет эндотелизацию микрофлюидного устройства. Это изображение было получено менее чем через 48 часов после посева с использованием описанного протокола, оптимизированная техника перфузии позволяет эндотелиальным клеткам свободно культивировать всю внутреннюю поверхность микрофлюидной системы.
В течение 24-48 часов после посева клеток. Как показано на этом конфокальном изображении, микрососудистая опухоль на чипе с микроканалами приближается к размеру 30 микрон посткапиллярного велеса, места большинства микрососудистых обструктивных событий серповидноклеточной анемии. В этом эксперименте цельная кровь здоровых пациентов вводится в микрососудистую сеть на чип-устройстве в условиях дезоксигенации.
Этот фильм показывает, что поток цельной крови в нашей эндотелиальной микрофлюидной системе регулярный, плавный и непрерывный, без участков обструкции микроканалов. Здесь цельная кровь пациентов с серповидноклеточной анемией вводится в микрососудистую систему на чип-устройстве. В условиях деоксигенации наблюдаются значительные изменения в кровотоке с полным присутствием окклюзий в нескольких каналах.
При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что при смене трубки не следует образовывать пузырьки воздуха. Готовый прибор совместим с флуоресцентной микроскопией и может быть адаптирован к традиционным флуоресцентным анализам. Этот метод открывает путь для экспериментальных гематологов к проведению экспериментов с использованием одиночных клеток в контролируемой биофизической и гемодинамической среде.
Никаких пузырей.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
В этой статье описан метод культивирования монояруса эндотелиальных клеток в микрофлюидном устройстве с каналами размером с микрососуды. Эта in vitro модель облегчает изучение взаимодействий между клетками крови, эндотелиальными клетками и растворимыми факторами при гематологических заболеваниях.