Сплит-Убиквитин основе дрожжей Мембрана два-Hybrid (МИФ) Система: Мощный инструмент для выявления белок-белковых взаимодействий

Система основана на концепции расщепленного убиквитина, которая подразумевает возможность стабильного разделения убиквитина на N-концевой фрагмент NUBI и C-концевой фрагмент CUB, способные восстанавливаться в полноразмерную молекулу псевдоубиквитина. В то время как такое восстановление происходит спонтанно при использовании NUBI дикого типа, введение мутации изолейцина-13 на глицин с образованием фрагмента, называемого NUBG, значительно снижает его сродство к CUB, тем самым блокируя формирование псевдоубиквитина. Если NUBG и CUB слиты с белком A и белком B соответственно, и белки A и B способны взаимодействовать, то молекула псевдоубиквитина может быть сформирована снова.

В методе myth интегральные мембранные «приманки» (baits) слиты с фрагментом CUB, связанным с искусственным транскрипционным фактором. В то время как «добычи» (preys) слиты с фрагментом NUBG, взаимодействие между приманкой и добычей приводит к реконституции псевдоубиквитина, который, в свою очередь, может распознаваться цитозольными деубиквитинилирующими ферментами, представленными в виде ножниц. Эти ферменты осуществляют расщепление после C-конца CUB, высвобождая транскрипционный фактор, который затем может проникнуть в ядро и активировать репортерную систему, что позволяет проводить селективную изоляцию и идентификацию клеток, в которых происходят взаимодействия приманки и добычи.

Здравствуйте, я Дженни Снайдер из лаборатории Игоря STAARs на кафедрах молекулярной генетики и биохимии Университета Торонто. Сегодня я продемонстрирую вам процедуру мембранного двухгибридного анализа, или M2H; мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения взаимодействий интегральных мембранных белков. Итак, приступим.

Перед проведением анализа Mammalian Two-Hybrid (Myth) убедитесь, что N- или C-конец вашего белка-приманки находится в цитозоле клетки. Метка CUB Lex A VP 16 должна быть слита с вашим белком на этом конце. Поскольку деубиквитинирующие ферменты, необходимые для высвобождения фактора транскрипции, локализованы в цитозоле, в случае, если топология вашего белка-приманки неизвестна, вы можете создать конструкции с метками на обоих концах (N и C) и, используя контрольный тест N-U-B-G-I, описанный ниже, определить, подходит ли какая-либо из них для использования в Myth, что укажет на то, что данный конкретный конец является цитозольным.

Затем определите, какой из двух основных вариантов метода myth подходит для вашего эксперимента. Для нативных белков дрожжей предпочтительным методом является интегрированный myth или immy. При использовании immy белки эндогенно метятся тегом CUB Lex a VP 16, оставаясь под контролем своего собственного нативного промотора.

Это является преимуществом, так как уровень экспрессии Bates дикого типа помогает устранить проблемы, связанные с гиперэкспрессией белка, такие как увеличение количества ложноположительных результатов для неродных дрожжевых белков; традиционный метод myth или T myth может использоваться, при котором приманки с метками CU B Lex A V VP 16 гиперэкспрессируются эктопически из плазмиды. В данном протоколе мы сосредоточимся на T myth, так как эта форма myth более широко применима; за исключением первоначального создания приманки и используемых сред, обе формы myth проводятся практически идентичным образом. Приманка должна быть клонирована в соответствующий вектор для маркирования и экспрессии.

В настоящее время доступно множество векторов T myth, таких как BV four, p, a, BV four и PCM BV four, которые позволяют конструировать белки с C-концевыми метками Bates, Beit Cub Lexie, VP 16 под контролем очень сильного промотора TF one, сильного A DH one и слабого CYC one соответственно. После выбора таргетного эффектора проведите рестрикцию плазмиды по соответствующему сайту рестрикции. Расщепление должно происходить строго в непосредственной близости от метки CU B Lxe VP 16: выше метки для C-концевого мечения или ниже — для N-концевого мечения.

Например, при использовании вектора PAM BV оптимальным выбором является SFI one; после того как плазмида была подвергнута рестрикции и хранилась при температуре -20 °C до момента использования, следующим шагом является разработка праймеров для амплификации и клонирования интересующего гена. 5'-конец прямого праймера должен соответствовать примерно 35–40 нуклеотидам выше по течению от сайта рестрикции. В то же время 3'-конец должен соответствовать первым 18–20 нуклеотидам целевого гена, которым является DRB two, кодирующий бета-2-адреногенный рецептор.

В нашем примере 5'-конец обратного праймера должен соответствовать обратно-комплементарной последовательности примерно 35–40 нуклеотидов ниже сайта рестрикции. 3'-конец должен соответствовать обратно-комплементарной последовательности последних 18–20 нуклеотидов целевого гена, исключая стоп-кодон, если CUB Lex или VP 16 тэг устанавливается на C-конец, как показано в данном примере. В зависимости от того, выполняется ли мечение N- или C-конца, убедитесь, что выбранные 35–40 нуклеотидов последовательности плазмиды, используемые в прямом или обратном праймере, обеспечат клонирование целевого гена в одной рамке считывания с CUB Lex или VP 16 тэгом. Поскольку в нашем примере будет мечен C-конец белка A DRB two.

35 оснований последовательности A MBV в обратном праймере были подобраны таким образом, чтобы последовательности генов A DRB два и CUB находились в одной рамке считывания; амплифицируйте целевой ген методом ПЦР с использованием выбранных праймеров. Параметры ПЦР будут зависеть от конкретного фермента и специфических праймеров, используемых для создания условий, при которых возможна гомологичная рекомбинация путем восстановления разрыва. Предварительно переваренную плазмиду и амплифицированный целевой ген трансформируют в соответствующий штамм дрожжей, используя стандартный протокол трансформации дрожжей, например, описанный Geets и Woods.

После того как трансформированные дрожжи вырастут на чашке, выберите одну колонию штамма и инокулируйте её в пять миллилитров среды SD без лейцина. Жидкую среду инкубируют при 30 °C в течение ночи; после этого, когда культура вырастет и достигнет насыщения, центрифугируйте клетки при 700 ×g в течение пяти минут и удалите супернатант. Выделите плазмидную ДНК-приманку из осадка клеток, используя любой коммерческий набор для мини-препа.

Следуйте стандартному протоколу с одним изменением для обеспечения достаточного лизиса клеток дрожжей: после первоначального ресуспендирования добавьте к осадку стеклянные бусины из содоизвесткового стекла в объеме 0,5 мM, затем интенсивно перемешивайте на вортексе в течение пяти минут. Далее следуйте коммерческому протоколу в обычном режиме. Трансформируйте выделенную ДНК дрожжей в химически компетентный штамм E. coli, подходящий для размножения плазмид, с эффективностью трансформации не менее 1 × 10⁷ клеток на мкг ДНК.

После выделения плазмидной ДНК из трансформированных клеток e coli, перед использованием необходимо подтвердить правильность конструкции примарочной плазмиды путем секвенирования. Штаммы с приманкой должны быть проанализированы, чтобы убедиться в правильной локализации белков-приманок в мембране дрожжей. Локализация определяется с помощью флуоресцентной микроскопии. Включение молекулы YFP в последовательность метки приманки позволит напрямую визуализировать живые клетки и широко применяется в imy.

В качестве альтернативы, после подтверждения правильной локализации приманки, можно использовать стандартный метод иммунофлуоресценции с применением антител к компонентам Lex A или VP 16 метки. Необходимо убедиться, что приманка не обладает способностью к самоактивации, то есть она не активирует репортерную систему самостоятельно или в присутствии не взаимодействующей добычи; для проверки отсутствия самоактивации приманки мы применяем тест N-U-B-G-I. В этом тесте.

Приманка трансформируется взаимодействующей положительной и не взаимодействующей отрицательной контрольными добычами, после чего различные разведения каждого трансформанта наносятся каплями на соответствующие селективные среды. Для того чтобы приманка была пригодна для использования в системе двухгибридного анализа, она должна расти на селективной среде в присутствии положительного контроля и не расти в присутствии отрицательного контроля. После валидации приманки штамм-репортер двухгибридного анализа, содержащий приманку, может быть трансформирован интересующей библиотекой добыч для скрининга белок-белковых взаимодействий.

Для начала этой крупномасштабной трансформации дрожжей инокулируйте одну колонию репортерного штамма, содержащего вашу «приманку», в 5 мл среды SD без лейцина и инкубируйте в течение ночи при 30 °C с перемешиванием. Перенесите ночную культуру в 200 мл среды SD без лейцина и инкубируйте при 30 °C с перемешиванием до достижения значения OD 600 от 0,6 до 0,7. По достижении целевого значения OD 600 разделите культуру объемом 200 мл между четырьмя центрифужными пробирками по 50 мл с завинчивающимися крышками и осадите клетки путем центрифугирования.

После промывки осадка стерильной дважды дистиллированной водой и раствором литий-ацетатного Трис-ЭДТА, мы суспендируем каждый осадок в 600 µL раствора литий-ацетатного Трис-ЭДТА в каждой из четырех центрифужных винтовых пробирок объемом 15 mL. К 600 µL ресуспендированных клеток добавляют 2,5 mL раствора ПЭГ с литий-ацетатом, 100 µL раствора ДНК спермы лосося и семь µg ДНК библиотеки «добычи». Протряхивают пробирки в течение одной минуты для обеспечения тщательного перемешивания, затем инкубируют на водяной бане при 30 °C в течение 45 минут.

После 45-минутной инкубации коротко перемешивайте содержимое каждые 15 минут. Добавьте в каждую пробирку 160 µL диметилсульфоксида или DMSO и немедленно перемешайте, переворачивая пробирки. Инкубируйте на водяной бане при 42 °C в течение 20 минут.

По завершении теплового шока соберите клетки путем центрифугирования и ресуспендируйте их. Каждую из полученных осадков ресуспендируйте в трех миллилитрах 2X YPAD. Объедините все образцы в одной 50-миллилитровой центрифужной пробирке с завинчивающейся крышкой.

Инкубируйте клетки при 30 °C в течение 90 минут для восстановления клеток. Центрифугируйте клетки и ресуспендируйте клеточный осадок в 4,9 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия, используя 100 мкл ресуспендированных клеток. Приготовьте десятикратные серийные разведения в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия в диапазоне от 10x до 10 000x; высейте по 100 мкл разведений 100x и 1000x на селективные среды и инкубируйте при 30 °C в течение двух-трех дней.

Эти чашки служат контролем и используются для аналогичного расчета эффективности трансформации. Разделите оставшиеся 4,8 миллилитра ресуспендированных клеток, высейте их на большие чашки диаметром 150 миллиметров и инкубируйте при 30 °C в течение трех-четырех дней. После появления колоний каждую отдельную колонию, представляющую клетки, содержащие потенциальную взаимодействующую пару «приманка-добыча», ресуспендируйте в 100 мкл 0,9% раствора хлорида натрия и высейте аликвоты по 5 мкл на селективные среды, содержащие XG; инкубируйте до роста в течение двух-четырех дней.

Колонии, демонстрирующие активный рост и синий цвет, отбирают для дальнейшего анализа. После выделения и секвенирования плазмид из положительных дрожжевых колоний следует собрать и проанализировать все данные секвенирования для составления предварительного списка интеракторов. Для повторной проверки этих взаимодействий применяется тест на зависимость от приманки.

В данном тесте все плазмиды «добычи» (prey), экспрессирующие выявленные интеракторы, трансформируют обратно в исходный штамм с «приманкой» (bait), а также в штамм, содержащий контрольную искусственную приманку, состоящую из одного трансмембранного домена, слитого с CUB Lex и меткой VP 16. Одиночные колонии, полученные в результате этих трансформаций, ресуспендируют в 100 µL стерильной дважды дистиллированной воды и наносят по 5 µL на соответствующие селективные среды с добавлением X sc. В идеале для каждой «добычи» следует отобрать несколько трансформантов, а исходную и искусственную приманки следует нанести на одну и ту же чашку. Пластины инкубируют от двух до четырех дней при 30 °C. Дрожжи, несущие искусственную приманку вместе с «добычей», которая вызывает активацию репортерной системы, считаются неспецифичными, и такая «добыча» исключается из списка интеракторов.

Наблюдайте рост и появление синей окраски дрожжей с интересующей приманкой, но не с искусственной приманкой. Это подтверждает специфическое взаимодействие. Если же дрожжи, содержащие добычу и вашу интересующую приманку, не растут.

Эта жертва удаляется из списка интеракторов. Оставшиеся объекты составляют полный список интеракторов, выявленных в ходе скрининга. По завершении данной процедуры у вас будет карта взаимодействий.

Это представляет собой совокупность потенциальных взаимодействий, которые исследователю необходимо дополнительно проанализировать с помощью конкретных исследований, определяемых в каждом отдельном случае. Для оценки биологической значимости каждого из них мы только что продемонстрировали, как проводить процедуру мембранного двухгибридного анализа или метод MYTH для идентификации белков-партнеров интересующего белка. При выполнении процедуры MYTH важно убедиться, что N- и/или C-конец вашего исследуемого белка расположен в цитозоле клетки, и соответствующим образом разработать стратегию маркировки.

Кроме того, важно тщательно убедиться, что ваши приманочные штаммы надлежащим образом экспрессируют приманку и что приманка локализована правильно. Также важно провести контрольный тест NUB GI, так как он полезен для установления условий скрининга. Наконец, обязательно независимо подтвердите все взаимодействия, обнаруженные с помощью системы myth.

Следование этим простым шагам позволит вам добиться наилучших результатов при выполнении данной процедуры. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.