Сплит-Убиквитин основе дрожжей Мембрана два-Hybrid (МИФ) Система: Мощный инструмент для выявления белок-белковых взаимодействий

Система мифов основана на концепции расщепленного убиквитина, которая относится к способности убиквитина быть стабильно разделенным на концевые и концевые половинки UBI и C CUB, способные восстанавливаться в полноразмерную молекулу псевдоубиквитина. В то время как это восстановление является спонтанным при использовании NUBI дикого типа, введение ISIN 13 в мутацию глицина, производство фрагмента под названием NUBG значительно снижает его сродство к CUV, тем самым блокируя образование убиквитина pseu. Если NUBG и CUB сливаются с белками А и В соответственно, а А и В способны взаимодействовать, то может снова образоваться молекула убиквитина pseu.

В мифе интегральные мембранные приманки сплавляются с атакой, состоящей из фрагмента CUB, связанного с искусственным транскрипционным фактором. В то время как похвалы сливаются с фрагментом NUBG, взаимодействие между приманкой и добычей приводит к восстановлению псевдоубиквитина, который, в свою очередь, может быть распознан цитозольными ферментами убиквитинирования, изображенными в виде ножниц. Эти ферменты расщепляются после С-конца CUB, высвобождая транскрипционный фактор, который затем может проникнуть в ядро и репортерную систему активатора, что позволяет селективно выделять и идентифицировать клетки, в которых происходят взаимодействия с добычей BA.

Здравствуйте, я Джени Снайдер из лаборатории Игоря STAARS на факультете молекулярной генетики и биохимии Университета Торонто. Сегодня я покажу вам процедуру использования двух гибридных мембран или мифов, и мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения взаимодействий интегральных мембранных белков. Итак, приступим.

Прежде чем проводить анализ мифов, убедитесь, что ваш белок-приманка имеет свои N- и/или C-концы в цитозоле клетки. Метка CUB Lex A VP 16 должна быть присоединена к белку в этом конце. Поскольку убиквитинированные ферменты, необходимые для высвобождения транскрипционного фактора, расположены в цитозоле, если топология вашего белка-приманки неизвестна, вы можете создать конструкции, помеченные как на конце NNC, так и с помощью контрольного теста N-U-B-G-I, кратко описать, посмотреть, подходит ли какой-либо из них для использования в myth, тем самым указывая на то, что конкретный конец является цитозольным.

Затем решите, какой из двух основных вариантов мифа подходит для вашего эксперимента. Для нативных дрожжевых белков предпочтительным методом является интегрированный миф или имми. В Imy Bates эндогенно помечены тегом CUB Lex VP 16, что оставляет их под контролем их родного промоутера.

Это является преимуществом, поскольку уровень экспрессии дикого типа Бейтса помогает устранить проблемы, связанные с гиперэкспрессией белка, такие как повышенное количество ложноположительных результатов для ненативных белков дрожжей, может быть использован традиционный миф или миф T, когда приманки CU B Lex A V VP 16 меток сверхэкспрессируются местно из плазмиды. В этом протоколе мы сосредоточимся на Т-мифе, поскольку эта форма мифа более широко применима, за исключением исходной конструкции приманки и используемой среды, обе формы мифа осуществляются по существу идентичным образом. Приманка должна быть клонирована в соответствующий вектор для тегирования и выражения.

В настоящее время доступны различные векторы Т-мифов, такие как BV четыре, p, a, BV четыре и PCM BV 4, которые позволяют конструировать c терминально меченые Bates, Beit Cub Lexie, VP 16 под контролем очень сильного TF одного сильного A DH one и слабого CYC one promoter соответственно. После того, как эффектор команды выбран, рестрикция расщепляет плазмиду в соответствующем месте рестрикции. Расщепление должно происходить только в непосредственной близости от метки CU B Lxe VP 16 вверх по потоку от метки для мечения на терминале C или ниже по течению для мечения на клемме N.

Например, при использовании вектора PAM BV, SFI one является идеальным выбором, после того как плазмида была расварена, сохранена при температуре минус 20 градусов Цельсия до готовности к использованию, следующим шагом является разработка праймеров для амплификации и клонирования интересующего гена. Пять основных концов прямого праймера должны совпадать примерно с 35 до 40 нуклеотидами выше по потоку от сайта рестрикции. В то время как три основных конца должны соответствовать первым 18-20 нуклеотидам гена-мишени, который представляет собой DRB-2, кодирующий бета-2 и общий рецептор.

В нашем примере пять простых концов обратного праймера должны соответствовать обратному комплементу примерно от 35 до 40 нуклеотидов ниже по потоку от сайта рестрикции. При этом три простых конца соответствуют обратному комплементу последних 18-20 нуклеотидов гена-мишени, пропуская стоп-код при размещении метки CUB Lex, скажем, VP 16 на С-конце, как это сделано в показанном примере, в зависимости от того, выполняется ли маркировка N или С-концев. убедиться, что выбранные от 35 до 40 нуклеотидов плазмидной последовательности, используемые в прямом или обратном праймере, приводят к клонированию гена-мишени в кадре с CU B Lex, меткой VP 16. Так как в нашем примере С-конец белка A DRB two будет помечен.

35 базис последовательности A MBV в обратном праймере были выбраны таким образом, чтобы последовательности генов A DRB, two и CUB лежали в одной и той же рамке считывания, амплифицировали интересующий ген методом ПЦР с использованием выбранных праймеров. Параметры ПЦР будут зависеть от конкретного фермента и конкретных праймеров, используемых для создания среды, в которой может произойти гомологичная рекомбинация с репарацией разрыва. Ранее переваренную плазмиду и амплифицированный ген, представляющий интерес, трансформируют в подходящий штамм дрожжей с использованием стандартного протокола трансформации дрожжей, подобного описанному Гетсом и Вудсом.

Как только трансформированные дрожжи вырастут на тарелке, выберите одну колонию штамма и внесите в нее пять миллилитров SD за вычетом лейцина. Жидкие среды растут при температуре 30 градусов Цельсия в течение ночи после того, как культура выросла за ночь и достигла насыщения. Центрифугируйте клетки со скоростью 700 GS в течение пяти минут и удалите надосадочную жидкость, изолируйте приманку плазменной ДНК из клеточной гранулы с помощью любого коммерческого мини-набора для подготовки.

Следуйте стандартному протоколу с одной модификацией для того, чтобы обеспечить достаточный лизис дрожжевых клеток при небольшом объеме 0,5 миллимолярного содового известкового стекла в грануле после начальной реактивной суспензии и энергично перемешайте в течение пяти минут. Затем продолжайте работу с коммерческим протоколом в обычном режиме. Трансформируйте выделенную ДНК дрожжей в химически компетентный штамм кишечной палочки, пригодный для размножения плазмид, с эффективностью трансформации не менее одного умноженного на 10 до семи клеток на микрограмм ДНК.

После забора плазменной ДНК из трансформированной кишечной палочки проверьте правильность строения приманочной плазмиды путем секвенирования перед использованием приманки, штаммы должны быть проанализированы, чтобы убедиться, что белки приманки правильно локализованы на мембране дрожжей. Локализацию определяют с помощью флуоресцентной микроскопии. Включение молекулы A YFP в последовательность бирок приманки позволит напрямую визуализировать живые клетки и обычно используется в imy.

В качестве альтернативы можно использовать стандартный иммунофлуоресцентный подход с использованием антител против компонентов метки Lex A или VP 16 после того, как будет установлена правильная локализация приманки. Необходимо убедиться, что приманка не является самоактивирующейся IE, она не активирует систему отчетности в одиночку или при наличии невзаимодействующей похвалы, чтобы убедиться, что приманка не является самоактивирующейся, мы используем тест N-U-B-G-I. В этом тесте.

Приманка преобразуется с взаимодействующей положительной и невзаимодействующей отрицательной контрольной похвалой, а затем различные разведения каждого трансформатора обнаруживаются на соответствующих селективных средах. Абате должен расти на селективных средах в присутствии положительного контроля и не расти в присутствии отрицательного контроля, чтобы быть пригодным для использования в мифе. После того, как приманка была проверена, штамм myth reporter, содержащий приманку, может быть преобразован с помощью библиотеки добычи, представляющей интерес, для скрининга белковых взаимодействий.

Чтобы начать эту крупномасштабную трансформацию дрожжей, инокулируйте одну колонию штамма myth reporter, содержащего вашу приманку, в пять миллилитров SD за вычетом лейциновой среды и инкубируйте в течение ночи при 30 градусах Цельсия с встряхиванием. Разведите ночную культуру в 200 миллилитрах SD за вычетом лейциновых сред и инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием до тех пор, пока не достигнет наружного диаметра 600 от 0,6 до 0,7. Когда будет достигнут целевой наружный диаметр 600, разделите культуру объемом 200 мл между четырьмя центрифужными пробирками с винтовой крышкой объемом 50 мл и соберите клетки с помощью центрифугирования.

После промывки гранул стерильной дважды дистиллированной водой и раствором ацетата лития трисси ДТА, мы суспензируем каждую гранулу в 600 микролитрах раствора ацетата лития трисси ДТА в каждую из четырех 15 миллилитровых винтовых центрифуговых пробирок. Добавьте 2,5 миллилитров раствора ацетата лития PEG, два 600 микролитров ресуспендированных клеток, 100 микролитров раствора ДНК спермы лосося и семь микрограммов ДНК библиотеки добычи четыре. Нанесите на пробирки текстовое сообщение в течение одной минуты, чтобы обеспечить тщательное перемешивание, а затем выдерживайте на водяной бане при температуре 30 градусов Цельсия в течение 45 минут.

Коротко перемешивайте каждые 15 минут после 45-минутной инкубации. Добавьте 160 микролитров диметилсульфоксида или ДМСО в каждую пробирку и немедленно перемешайте, перевернув пробирки. Выдерживать на водяной бане при температуре 42 градуса Цельсия в течение 20 минут.

Когда тепловой шок завершится, соберите клетки с помощью центрифугирования и реанимации. Суспензируйте каждую из гранул по три миллилитра по два Х-У--А-Д. Соберите все образцы вместе в одной центрифужной пробирке объемом 50 миллилитров с винтовой крышкой.

Инкубируйте клетки при температуре 30 градусов Цельсия в течение 90 минут для восстановления клеток. Центрифугируйте клетки и ресуспендируйте клеточную гранулу в 4,9 миллилитрах стерильного 0,9% хлорида натрия с использованием 100 микролитров ресуспендированных клеток. Приготовьте десятикратное серийное разведение в стерильном 0,9% хлорида натрия в диапазоне от 10 x до 10 000 x планшета, 100 микролитров 100 x и 1000 x разведения на селективной среде и инкубируйте при 30 градусах Цельсия в течение двух-трех дней.

Эти пластины служат в качестве контроля и используются для расчета эффективности преобразования в равной степени. Разделите оставшиеся 4,8 миллилитров ресуспендированных клеток и планшет на большие 150-миллиметровые пластины и инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия в течение трех-четырех дней. После того, как колонии выросли, ресуссоры суспензируют отдельные колонии, каждая из которых представляет собой клетки, содержащие потенциальную взаимодействующую пару приманки, в 100 микролитрах 0,9% хлорида натрия и помещают пять микролитров аликвот в селективную среду, содержащую XG, позволяют расти только в течение двух-четырех дней.

Для дальнейшего анализа отбираются колонии, которые демонстрируют устойчивый рост и синий цвет. После выделения и секвенирования плазмид из положительных колоний дрожжей соберите и проанализируйте все данные секвенирования, чтобы составить предварительный список взаимодействующих агентов. Для повторной проверки этих взаимодействий используется тест зависимости от приманки.

В этом тесте все плазмы добычи, экспрессирующие идентифицированных интеракторов, преобразуются обратно в исходный штамм приманки, а также в штамм, содержащий контрольную искусственную приманку, состоящую из одного трансмембранного домена, слитого с CUB Lex, метка VP 16 ресуспендирует отдельные колонии от этих превращений в 100 микролитрах стерильной дважды дистиллированной воды и обнаруживает пять микролитров объемов под соответствующей селективной средой плюс X sc. В идеале, Для каждой добычи должно быть выбрано несколько трансформантов, и как оригинальная, так и искусственная приманка должны быть размещены на одной и той же пластине. Инкубируйте планшеты в течение двух-четырех дней при температуре 30 градусов Цельсия дрожжи, несущие искусственную приманку, в добычу, вызывающую активацию репортерной системы, считаются беспорядочными и эта конкретная добыча исключается из списка взаимодействующих веществ.

Похвала, которая вызывает рост и синюю окраску у дрожжей с приманкой, представляющей интерес, но не с искусственной приманкой. Подтвердите конкретное взаимодействие. Если же дрожжи, укрывающие добычу и вашу приманку, интересовать не получится.

Эта добыча удаляется из списка интеракторов. Остальные похвалы составляют полный список взаимодействующих лиц, идентифицированных на экране мифов. По завершении процедуры мифа у вас будет карта дома взаимодействия.

Это представляет собой набор возможных взаимодействий, которые исследователь должен дополнительно проанализировать с помощью конкретных исследований, определяемых в каждом конкретном случае. Чтобы оценить биологическую значимость каждого из них, мы только что показали вам, как провести процедуру гибрида мембраны E two для идентификации взаимодействующих партнеров интересующего белка. При выполнении процедуры мифа важно убедиться, что интересующее вас существо имеет свой конец и/или С-конец, расположенный в сито ячейки, и соответствующим образом разработать свою стратегию тегирования.

Кроме того, важно тщательно оценить, правильно ли сцеживаются ваши штаммы приманки и что приманка правильно локализована. Кроме того, важно провести тест NUB GI Control, так как он полезен для определения условий скрининга. Наконец, обязательно независимо проверяйте все взаимодействия, которые вы обнаруживаете с помощью мифа.

Следование этим простым шагам должно гарантировать, что вы получите наилучшие возможные результаты от процедуры мифа. Ну вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.