Импульсно-погони Анализ N-связанных цепей сахар из гликопротеинов в клетках млекопитающих

Анализ несвязанных сахарных цепей гликопротеинов начинается с мечения гликанов и клеток тритиевым маннозом. Чашку с импульсной меткой охлаждают на льду, в то время как чашку с «погоней» инкубируют без метки в течение заданного периода вымывания. Затем образцы лизируют, интересующий гликопротеин подвергают иммуноочистке в денатурированном состоянии, после чего его гликаны высвобождают ферментативным путем.

Олигосахариды дополнительно очищают методом молекулярной фильтрации, которая позволяет отделить их от белков и других загрязняющих веществ с молекулярной массой более 30 kilodaltons. Затем гликаны разделяют с помощью HPLC. Количество каждой формы гликана определяют путем измерения интенсивности радиоактивного сигнала в каждой элюированной фракции.

Здравствуйте, я Эдвард Азо из лаборатории Геральдо Леттера Кремера на кафедре клеточных исследований и иммунологии Тель-Авивского университета. Я также представляю лабораторию Геральдо Леттера Кремера. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру выделения и анализа метаболически меченных и связанных олигосахаридов.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения динамики переработки сахарных цепей как для общего пула клеточных гликопротеинов, так и для отдельных гликопротеинов. Итак, приступим. Для начала процедуры используйте клетки NIH 3T3, выращенные в течение ночи в одной чашке диаметром 90 мм.

Для каждого образца культура должна быть субконфлюэнтной, чтобы вызвать глюкозное голодание клеток. Приготовьте свежую двухкратную (2х) среду без глюкозы с добавлением 20% диализованной FCS и 8 мM пирувата натрия; разбавьте один объем необходимого количества 2х среды одним объемом деионизированной воды. Подогрейте среду, затем инкубируйте каждый образец клеток в 5 мл свежей подогретой среды в течение 5–15 минут. Если требуется период вымывания (chase) более 12 часов, с клетками следует работать в стерильных условиях.

По окончании периода инкубации маркируйте чашки, соответствующие образцам импульса и вымывания. Для мечения N-гликанов с целью анализа гликопротеинов методом иммунопреципитации замените среду для голодания на 1 mL предварительно подогретой среды без глюкозы, дополненной 400 µCi/mL маннозы, меченной тритием. Для мечения и анализа общего пула гликопротеинов используйте концентрацию 65 µCi/mL.

После замены среды для голодания инкубируйте клетки в стандартных условиях культивирования тканей в течение одного часа. По истечении одного часа инкубации удалите маркирующую среду из всех образцов. Осторожно добавьте два миллилитра PBS при температуре четырех градусов Цельсия в образцы, соответствующие импульсу, и поместите их на лед. Эти образцы называют импульсными.

Используйте два миллилитра предварительно подогретой стандартной полной культуральной среды. Промойте образцы после вытеснения (чейз-образцы) три раза. Затем добавьте к клеткам пять миллилитров предварительно подогретой стандартной среды.

Поместите образцы для этапа «погони» в инкубатор с углекислым газом при 37 °C на требуемое время. Во время инкубации образцов для «погони» промойте образцы для этапа «импульса», которые находились на льду, трижды, используя по 2 мл ледяного PBS. Затем с помощью скребка для клеток снимите клетки с чашки.

Перенесите высвобожденные клетки в пробирку EOR объемом 2 мл, содержащую 2 мл PBS. Центрифугируйте клетки при 16 000 g в течение 6–10 секунд, чтобы осадить клетки, и заморозьте клеточный осадок при −80 °C. По завершении инкубации образцов с добавлением трейсера промойте их.

Центрифугируйте и храните образцы, как показано для импульсных проб. Когда наступит время приступать к лизису клеток, извлеките их из морозильной камеры. Для анализа IP проведите лизис клеток, добавив 300 µL буфера.

Кратковременно перемешайте на вортексе и инкубируйте в течение 20 минут на льду. Для анализа образцов общих гликопротеинов добавьте 300 µL буфера B. Инкубируйте клетки в течение 20 минут на льду, затем проведите соникацию четыре раза по 10 секунд с максимальной амплитудой. После этого прокипятите образцы в течение пяти минут.

Наконец, центрифугируйте все лизаты при 16, 000 Gs в течение 20 минут при температуре четырех градусов Цельсия. Перенесите супернатант в новую пробирку EOR, а осадок удалите. Переходите к IP для изучения целевого белка с целью иммунопреципитации гликопротеина H two A, продемонстрированного здесь.

Добавьте в супернатант лизированных клеток 20 µL на образец белка A agarose и 3 µL на образец кроличьих поликлональных антител против H2A. Инкубируйте образцы от 4 до 16 часов при 4 °C при постоянном перемешивании путем медленного вращения. По окончании инкубации осадите гранулы центрифугированием и осторожно удалите супернатант с помощью вакуума, затем четырежды промойте гранулы, добавляя по 500 µL буфера TEA.

Центрифугируйте пробу для осаждения гранул и удалите супернатант, чтобы высвободить связанные белки из гранул. Добавьте 10 µL денатурирующего буфера из набора endo H к осадку гранул и кипятите образцы в течение пяти минут. Центрифугируйте пробу для осаждения гранул и перенесите супернатант в новую пробирку EOR.

Белки ellu теперь готовы к дегликозилированию. Гликаны высвобождаются как из образцов после иммунопреципитации (IP), так и из образцов общего белка с помощью фермента Endo H. В образцы IP добавьте 0,5 µL фермента Endo H и 10 µL 2х реакционного буфера для Endo H. Инкубируйте образцы при 37 °C в течение трех часов.

Для анализа общего содержания гликопротеинов перенесите супернатант лизатов клеток в фильтр MicroCon с пределом отсечения 30 кДа. Промойте экстракт общего белка трижды, используя по 100 µL буфера E, путем многократного центрифугирования при 14 000 G в течение трех минут. Добавьте в MicroCon 3 µL 10-кратного реакционного буфера endo H и 1,5 µL фермента endo H туда, где остались промытые белки, и инкубируйте в течение трех часов при 37 °C вместе с образцами IP.

По окончании трехчасовой инкубации разбавьте образец IP пятикратно деионизированной водой, поместите его на новый фильтр MicroCon и центрифугируйте при 14, 000 Gs в течение трех минут. Затем промойте образцы IP и общего белка, добавив 50 µL деионизированной воды и центрифугируя их; повторите эту процедуру еще дважды. При желании сохраните фильтрат, содержащий отщепленные гликаны, в пробирках с endo H. Затем гликопротеины, устойчивые к endo H, инкубируют с 200 mU N-гликозидазы F в 15 µL буфера C при 37 °C в течение 16 часов.

Элюирование деионизированной водой проводится так, как показано выше. Полностью высушите образцы с помощью вакуум-концентратора с нагревом до 45 °C для ускорения процесса. Ресуспендируйте сухие осадки в 12 µL растворителя для ВЭЖХ и нанесите образцы на колонку Sphere или amino, установленную в приборе ВЭЖХ.

Проведите анализ образцов в соответствии с прилагаемым письменным протоколом. Соберите 48 фракций для каждого запуска образца. Используйте сцинтилляционный счетчик для измерения значений CPM собранных фракций и постройте график зависимости показаний CPM от номера фракции.

Рассчитайте процент остатков маннозы для всех видов гликанов, как описано в прилагаемом письменном протоколе. Ниже представлены репрезентативные результаты анализа сахарных цепей общих гликопротеинов из образца с одночасовой импульсной меткой. Показатели CPM фракций ВЭЖХ отложены в зависимости от номера фракции на полученном профиле.

Каждый пик представляет собой конкретный вид гликана, идентифицированный с помощью ВЭЖХ-анализа известных стандартов гликанов. Для каждого вида гликанов его молярный процент от общего количества гликанов отложен в зависимости от времени вытеснения (chase). Приведенный здесь анализ выполнен для конкретного неправильно свернутого гликопротеина, выделенного методом иммунопреципитации из образца, обработанного ингибитором протеасом MG 1 32.

Усеченный вид гликана M56 накапливается в период вымывания, что позволяет сделать вывод о том, что олигосахариды, находящиеся на неправильно свернутых белках, подвергаются экстенсивному отщеплению маннозы перед деградацией. Это контрастирует с олигосахаридами в составе общих гликопротеинов из образцов, обработанных аналогичным образом. В данном случае M98 остается основным видом гликана в течение периода вымывания, при этом наблюдается лишь незначительное увеличение количества M56. Это приводит к выводу, что только небольшая часть общего пула гликопротеинов направляется на ERAD (деградацию белков, ассоциированную с эндоплазматическим ретикулумом).

Сокращенный радиус. Как более подробно описано в прилагаемом письменном протоколе, мы только что продемонстрировали вам, как использовать сочетание мечения в живых клетках и анализа методом ВЭЖХ для отслеживания динамики состава несвязанных олигосахаридов на протяжении жизненного цикла гликопротеина. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости избегать загрязнения образцов этапа вытеснения следами радиоактивных мономеров, что приведет к нежелательному мечению гликанов в периоды вытеснения во время разделения по размеру.

Также важно настроить ВЭЖХ на постоянное давление, чтобы обеспечить однородность фракционирования гликанов. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.