SDS-PAGE/Immunoblot Обнаружение Ар мультимеров в населенных корковой ткани гомогенатах использованием антиген-эпитопов поиска

Данный протокол позволяет обнаружить бета-мальтерс в тканях коры головного мозга человека. Сначала гомогенизированную ткань подвергают ультразвуковой обработке с помощью зонда и очищают путем центрифугирования при низкой скорости. Затем образцы восстанавливают, кипятят в SDS-буфере и наносят на полиакриламидный гель.

Белки из геля переносятся на нитроцеллюлозную мембрану, которую затем подвергают пропариванию в фосфатно-солевом буферном растворе. В завершение мембрану инкубируют в течение ночи на орбитальном шейкере с первичными антителами, затем с конъюгированными с HRP вторичными антителами и, наконец, с люминальным пероксидным реагентом перед экспозицией на рентгеновской пленке. Здравствуйте, я Ребекка Розен из лаборатории Ларри Уокера с кафедры нейробиологии Национального центра исследований приматов Йеркса при Университете Эмори.

Сегодня мы продемонстрируем вам способ детектирования мультимеров Abeta и гомогенов коры с помощью электрофореза в SDS-геле и иммуноблоттинга с термически индуцированным восстановлением антигенов. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения уровней и распределения различных мультимеров Abeta в нефиксированных тканях коры головного мозга людей с болезнью Альцгеймера и пожилых приматов. Итак, приступим.

Возьмите около 100 мг нефиксированной ткани коры и гомогенизируйте ее примерно в 400 µL ледяного буфера, совершив около 30 равномерных движений пестиком. Для получения концентрации 20% масс/объем соотношение веса ткани к объему буфера должно составлять 1 мг на 4 µL. После гомогенизации перенесите гомогенаты в полипропиленовую пробирку объемом 4 мл и проведите ультразвуковую обработку зондом трижды по 5 секунд при мощности 5.

После соникации перенесите гомогенаты в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируйте в течение пяти минут при 3000 G, осторожно снимите осветленные супернатанты и храните аликвоты этих экстрактов объемом 50 µL при температуре -80 °C до использования. Затем определите общую концентрацию белка в свежеоттаявших аликвотах осветленных гомогенатов с помощью биоацидного анализа или анализа BCA согласно инструкциям производителя; осветленные 20% гомогенаты коры должны иметь концентрацию белка более 5 µg/µL и, следовательно, могут быть разбавлены в соотношении 1:10, чтобы попасть в диапазон считывания планшетного ридера. Для анализа BCA подготовьте денатурирующие пробы с использованием тех же аликвот осветленных гомогенатов.

Используйте примерно 50–60 µg общего белка и соответствующим образом отрегулируйте объем гомогенатов коры таким образом, чтобы в каждом из них содержалось одинаковое количество общего белка. Подготовьте образцы общим объемом 25 µL для каждого 10–20% Трис-геля, который будет подвергнут электрофорезу. Для каждого геля подготовьте положительный контроль, содержащий от 10 до 100 ng синтетического пептида a beta 40 или a beta 42, разведенного в 1X PBS до объема 10 µL с добавлением 12,5 µL 2X SDS-буфера для образцов и 2,5 µL 10x восстановителя.

После подготовки всех образцов, включая бета-контроль, перемешайте их на вортексе в течение 5–10 секунд и нагрейте в сухом термостате при 100 °C в течение пяти минут, затем быстро центрифугируйте все пробирки для удаления конденсата с крышки. Нанесите образцы на гель, погруженный в Трис-SDS электрофоретический буфер в электрофоретической кювете, и заполните как минимум одну лунку 10 µL неразбавленного маркера молекулярной массы. Проведите электрофорез при постоянном напряжении 125 В в течение примерно 90 минут или до тех пор, пока маркер 4 kDa не окажется примерно в одном сантиметре от нижнего края геля.

Осторожно извлеките гели из пластиковых кассет и соберите «сэндвич» для переноса в соответствии с инструкциями производителя. Предварительно смочите фильтровальные прокладки и нитроцеллюлозные мембраны толщиной 1 мкм в трансферном буфере с трис-глицином. Удалите все пузырьки воздуха из фильтровальных прокладок или из «сэндвича» с фильтровальной бумагой и мембраной.

Заполните внутреннюю камеру устройства для переноса трансферным буфером, а внешнюю камеру — дистиллированной водой. Проводите перенос в течение двух-трех часов при постоянной силе тока 25 milliamps. По завершении переноса разберите «сэндвич», поместите гели в чашку с дистиллированной водой, а мембраны — в чашку с 1× PBS для всех последующих этапов протокола.

Убедитесь, что гели и мембраны полностью покрыты жидкостью во избежание их высыхания. Чтобы визуализировать эффективность переноса белков, окрасьте гели неразбавленным красителем Simply Blue Safe в течение примерно одного часа, а мембраны — красителем PON S red 1x в течение примерно пяти минут. Время инкубации следует проводить в соответствии с инструкциями производителя; данное окрашивание не будет препятствовать проведению иммуноблоттинга.

Если окрашивание указывает на неэффективный перенос белков, измените время переноса на этапе три для восстановления антигенов. Поместите мембрану в прочный пластиковый пакет CapEx, заполненный примерно 50 миллилитрами 1X PBS при комнатной температуре, и герметично запечатайте его. Положите пакет горизонтально в предварительно разогретый до 100 °C парогенератор; как только пакет начнет расширяться, инкубируйте его еще 15 минут, после чего извлеките из парогенератора.

Дайте мембране медленно остыть до комнатной температуры перед извлечением из пакета, чтобы предотвратить ее чрезмерное сморщивание. Осторожно извлеките мембрану из пакета и промывайте ее в течение пяти минут в 1 XPBS на орбитальном шейкере, затем еще пять минут промывайте в TBST на орбитальном шейкере. Далее инкубируйте мембрану в блокирующем растворе в течение одного часа на орбитальном шейкере без промывки, после чего перенесите мембрану в чашку с первичным антителом 6 E 10, специфичным к терминальной области A beta, разведенным в блокирующем растворе в пропорции от 1:1000 до 1:5000.

Инкубируйте на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение одного часа, а затем от 24 до 48 часов при перемешивании при температуре 4 °C. После одного быстрого ополаскивания промывайте мембрану в течение 30 минут. В TBST затем проведите три 10-минутных ополаскивания на орбитальном шейкере.

Инкубируйте мембрану с вторичными антителами, конъюгированными с HRP, в разведении 1:10 000 в блокирующем растворе в течение 90 минут на шейкере при комнатной температуре. В данном протоколе используются антитела овцы против US. Затем повторно промойте мембрану в TBST в течение 30 минут: сначала одно быстрое промывание, затем три промывания по 10 минут на орбитальном шейкере.

После последнего промывания инкубируйте мембрану в свежеприготовленных неразбавленных реагентах Super Signal West Pico ECL в течение пяти минут. Снимите мембрану с шейкера, работающего на высоких оборотах, и удалите излишки реагента. С помощью безворсовой фильтровальной бумаги или салфеток Kimwipes поместите мембрану в кассету для пленки между защитными пластиковыми листами, удалив остатки реагента Super Signal безворсовыми салфетками Kimwipes.

При необходимости экспонируйте пленку Kodak Biomax MR.Film интервалами по 30 секунд в течение времени до 30 минут, после чего проявите ее в проявителе для пленок. В данном эксперименте полосы мономеров A beta, вероятно, станут насыщенными через пять минут. Были проанализированы осветленные гомогенаты, содержащие 50 мкг общего белка от семи доноров-людей, на наличие мультимерного бета-амилоида или A beta и белка-предшественника амилоида или APP — трансмембранного белка, из которого отщепляется пептид A beta.

Здесь представлены репрезентативные изображения результатов вестерн-блоттинга A beta и APP при экспозиции 30 минут и 5 минут. Экспозиция в течение 30 минут позволяет визуализировать гораздо более слабые полосы димеров, тримеров, тетрамеров и высокомолекулярных олигомеров Abeta, однако приводит к переэкспозиции других дорожек. При экспозиции в 5 минут та же полоса тетрамера присутствует, но выражена слабо, что позволяет четко визуализировать остальные дорожки.

В дорожках с первой по третью представлены гомогенаты коры головного мозга субъектов с болезнью Альцгеймера (БА). В четвертой дорожке — образец человека с диагнозом «деменция с тельцами Леви» (ДТЛ) и болезнью Альцгеймера. В пятой и шестой дорожках — случаи деменции с тельцами Леви, а в седьмой — образец пожилого человека без деменции (контроль). Иммуноблоттинг с использованием антитела 6C10 выявил мономеры, димеры, тримеры, тетрамеры и олигомеры Aβ во всех случаях болезни Альцгеймера, а также большое количество высокомолекулярных олигомеров Aβ в двух случаях БА, что указывает на гетерогенность агрегации Aβ между людьми.

Полоса бета 40 в правой дорожке подтверждает идентичность полос с меньшей молекулярной массой. Мы только что продемонстрировали вам эксперимент по вестерн-блоттингу с использованием SDS-PAGE для идентификации бета-мультимеров в нефиксированных гомогенатах тканей мозга людей с нейродегенеративными заболеваниями. При выполнении данной процедуры важно подготовить высококонцентрированные гомогенаты коры для разделения методом гель-электрофореза, чтобы выявить менее распространенные мультимеры Abeta.

Также важно провести heat-induced antigen epitope retrieval (тепловую демаскировку антигенов) перед проведением иммуноблоттинга с использованием антител к пептиду Abeta. Демаскировка антигенов помогает выявить скрытые эпитопы Abeta для оптимального связывания антител в процессе иммуноблоттинга. Для этого подойдет любой парогенератор, микроволновая печь или водяная баня, поддерживающие температуру 100 °C.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.