Эукариотические Polyribosome Анализ профиля
15 июня 2010 г.
В этой статье описывается протокол для извлечения переводе рибосом из эукариотических клеток. После извлечения, рибосомы разделены на monosomes и полирибосом сахарозы фракционирования градиент чтобы позволить различным рибосомных популяций для анализа. Таким образом, этот метод является золотым стандартом для изучения регуляции трансляции.
Общая цель данной процедуры заключается в разделении и сравнении фракций моносом и полисом из клеточных лизатов. Это достигается путем предварительного культивирования интересующих клеток. Вторым этапом процедуры является приготовление клеточного лизата.
Третьим этапом процедуры является центрифугирование лизата в градиенте сахарозы. Заключительный этап процедуры заключается в фракционировании градиента и визуализации различных популяций рибосом с помощью УФ-детектирования. В конечном итоге анализ профиля полисом позволяет получить результаты, демонстрирующие изменения в трансляции при различных экспериментальных условиях.
Здравствуйте, я Энтони Эспозито из лаборатории доктора Терри Госс Кинси с кафедры молекулярной генетики, микробиологии и иммунологии Университета Мэриленда (UMD) и Медицинской школы имени Дж. Роберта Вуда Джонсона. А я Маркус Льюис, также из лаборатории Кинси здесь, в R-W-J-M-S.
Сегодня мы продемонстрируем процедуру анализа полисом. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения изменений в синтезе белка, вызванных мутациями или воздействием факторов окружающей среды. Итак, приступим. Сахароза.
Градиенты следует подготавливать за один день до использования, чтобы они стали непрерывными. Смешайте соответствующие объемы стоковых растворов сахарозы 7% и 47%, чтобы приготовить по 48 миллилитров растворов сахарозы следующих концентраций: 7%, 17%, 27%, 37% и 47%. Добавьте одномолярный DTT в каждый раствор сахарозы до конечной концентрации один миллимоляр. Для заливки градиентов прикрепите паста-пипетку к шприцу объемом 20 миллилитров, зафиксировав и герметизировав соединение парафильмом.
Добавьте семь миллилитров 7% сахарозы на дно центрифужной пробирки из полиамера размером 1 дюйм на 3,5 дюйма. Затем добавьте семь миллилитров 17% раствора сахарозы под 7% раствор, поместив наконечник пастеризованной пипетки близко к дну пробирки и медленно вводя жидкость. Наливание каждого слоя должно занимать не менее 20 секунд.
Повторите процедуру, используя по семь миллилитров растворов сахарозы с концентрацией 27%, 37% и 47%, когда градиент будет сформирован. Вы должны увидеть четкие линии между слоями, что указывает на минимальное перемешивание. Храните все градиенты при температуре четырех градусов Цельсия в течение ночи вместе с роторами, флаконами и пробирками, которые будут использоваться для сбора образцов.
Для подготовки экстрактов из клеток дрожжей начните с выращивания 25 мл культуры дрожжей до OD 600 от 0,8 до 1. Добавьте в культуру циклогексимид до конечной концентрации 100 µg/mL и продолжайте перемешивание при 30 °C в течение 15 минут. По истечении 15 минут перелейте культуру в центрифужную пробирку объемом 250 мл и поместите в лед.
С этого момента держите все образцы на льду; центрифугируйте при 8,000 ×g в течение пяти минут при 4 °C. Ресуспендируйте осадок в 10 мл ледяного лизирующего буфера и перенесите в полипропиленовые пробирки объемом 15 мл. Центрифугируйте при 5,900 ×g в течение трех минут при 4 °C. Ресуспендируйте.
Ресуспендируйте осадок в 0,5 миллилитрах лизирующего буфера. Перенесите суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, затем добавьте 0,5 миллилитра охлажденных стеклянных бусин, промытых кислотой и прокаленных. Перемешивайте клетки на вортексе интервалами по 4/32 секунды, помещая пробирку на лед на 30 секунд между каждым интервалом.
Затем добавьте еще 0,5 мл буфера для лизиса в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 5 000 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте на максимальной скорости в течение 10 минут при температуре 4 °C.
Наконец, перенесите супернатант в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл. Экстракт можно хранить при температуре -80 °C до момента переноса лизата в сахарозный градиент. Приставьте кончик пипетки к стенке пробирки у поверхности градиента и аккуратно нанесите лизат поверх градиента.
Для градиента объемом 35 миллилитров обычно наносят 500 микролитров лизата. С помощью пинцета осторожно поместите градиент в стакан ротора с поворотными стаканами. Центрифугируйте градиенты при 100 000 ×g в течение четырех часов при температуре четыре градуса Цельсия.
Примерно за 30 минут до завершения четырехчасового центрифугирования установите иглу в прокалыватель пробирок, а ручку — в онлайн-монитор абсорбции и флуоресценции. Включите питание монитора абсорбции, чтобы перед анализом образцов была достигнута стабильная базовая линия.
Электронную запись профиля PolyZone можно легко получить в режиме реального времени, подключив блок сбора данных DI 1 48 U. Для подключения к регистратору заполните шприцевой насос 50 миллилитрами florin nuts, используя настройку быстрого обратного потока. Убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха.
Подсоедините шланг от шприца к прокол-адаптеру трубки. Кратковременно включите поток Flo inert со скоростью 6 мл/мин в прямом направлении. Чтобы удалить из шланга пузырьки воздуха, поместите серию пробирок под шланг на выходе из проточной кюветы для сбора сливного образца.
Подготовьте стакан с измельченным льдом, в котором предварительно сформировано отверстие для удержания центрифужной пробирки с градиентом сахарозы. По завершении четырехчасового центрифугирования осторожно извлеките центрифужные пробирки из ротора центрифуги и поместите их на лед, стараясь не нарушить градиенты.
Для анализа клеточных экстрактов поместите градиентную пробирку на прокалыватель пробирок, подключите верхнюю часть пробирки к выходу и зафиксируйте. Поднимите нижний столик к центрифужной пробирке так, чтобы игла проколола дно пробирки. Запустите поток Florin alert в прямом направлении со скоростью 6 мл/мин.
Как только флуот начнет поступать в пробирку, следите за движением стрелки на онлайн-мониторе УФ-абсорбции. Как только стрелка начнет двигаться, включите движение диаграммы, установив скорость на значение 60. По достижении конца профиля полисом, перекройте поток Flo inert в центрифужную пробирку и остановите движение диаграммы на мониторе абсорбции и флуоресценции.
Отодвиньте Flo inert из центрифужной пробирки обратно в шприц, запустив поток в обратном направлении с высокой скоростью, следя за тем, чтобы сахароза из пробирки не попала в шприц. Открутите центрифужную пробирку от проколки для пробирок, опустите иглу и извлеките пробирку. Здесь представлен типичный график экстракта рибосом, приготовленного из дрожжей в присутствии cyclo heximide.
Указаны пики УФ-абсорбции, соответствующие полирибосомам, а также 60 s и 40 s рибосомам. Мы только что продемонстрировали вам способ проведения анализа полирибосом. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости работать быстро, поддерживая образцы в охлажденном состоянии и обеспечивая защиту РНК от деградации.
На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Обзор
В данной статье описывается протокол экстракции транслирующих рибосом из эукариотических клеток, позволяющий проводить анализ различных популяций рибосом. Метод основан на разделении рибосом на моносомы и полирибосомы с помощью фракционирования в сахарозном градиенте, что имеет решающее значение для изучения регуляции трансляции.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Генетика
Теоретические основы
- Понимание функций рибосом имеет решающее значение для изучения синтеза белков.
- Полисомный профиль позволяет получить представление о регуляции трансляции.
- Методы экстракции рибосом являются основополагающими в исследованиях по молекулярной биологии.
- Факторы окружающей среды и мутации могут изменять синтез белков.
Цель исследования
- Разделение и сравнение фракций моно- и полирибосом из клеточных лизатов.
- Визуализация различных популяций рибосом с помощью УФ-детектирования.
- Анализ изменений трансляции при различных экспериментальных условиях.
Используемые методы
- Культивирование эукариотических клеток и подготовка клеточных лизатов.
- Центрифугирование в градиенте сахарозы.
- Фракционирование градиента для выделения популяций рибосом.
- Визуализация рибосомальных профилей с помощью мониторинга УФ-поглощения.
Основные результаты
- Успешное разделение моносом и полирибосом.
- Четкая визуализация популяций рибосом с помощью УФ-детектирования.
- Анализ регуляции трансляции при различных условиях.
- Изучение влияния мутаций на синтез белков.
Выводы
- Данный протокол является «золотым стандартом» для изучения регуляции трансляции.
- Он позволяет исследователям эффективно анализировать рибосомальную динамику.
- Полученные результаты способствуют пониманию молекулярных механизмов трансляции.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Анализ профилей полирибосом позволяет биофармацевтическим группам исследовать механизмы трансляционного контроля и выявлять дефекты синтеза белков на критических этапах поиска новых лекарственных средств. Этот метод дает количественное представление о глобальной и транскрипт-специфичной трансляции, что повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней и снижении механистических рисков. Его адаптивность к различным эукариотическим системам обеспечивает широкую применимость для портфеля ранних этапов НИОКР и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить прямую оценку трансляционной регуляции при генетических или средовых воздействиях.
- Обеспечивает механистическую проверку гипотез путем разграничения дефектов инициации и элонгации/терминации.
- Способствует функциональной валидации мишеней за счет количественного определения изменений соотношения полирибосом и моносом.
- Предоставляет платформу для оценки влияния потенциальных терапевтических воздействий на синтез белка.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированные количественные показатели связывания рибосом для стандартизации анализа.
- Позволяет осуществлять воспроизводимое фракционирование и УФ-детектирование популяций рибосом.
- Обеспечивает подготовку биологических экстрактов, подходящих для последующего анализа мРНК или белков.
- Поддерживает скрининг соединений, модулирующих аппарат трансляции или регуляторные пути.
Трансляционные и доклинические исследования
- Связывает поиск трансляционных биомаркеров с пониманием механизмов регуляции синтеза белка.
- Обеспечивает преемственность от клеточных моделей к доклиническим системам путем адаптации протоколов для различных видов эукариот.
- Позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков, выявляя трансляционные дефекты, связанные с моделями заболеваний.
- Обеспечивает понимание механизмов, лежащих в основе фенотипов, наблюдаемых в ходе доклинических исследований.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Полирибосомное профилирование интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, позволяя проводить проверку гипотез в отношении трансляции, что способствует как валидации мишеней, так и поиску перспективных соединений.
- Биология открытий: позволяет количественно оценить выход трансляции и выяснить специфические для конкретного пути регуляторные механизмы.
- Скрининг: обеспечивает надежное количественное фракционирование и данные УФ-абсорбции для подготовки анализа.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение популяций рибосом в режиме реального времени для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает клеточные и доклинические модели, позволяя адаптировать протоколы и согласовывать биомаркеры.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократная платформа для различных трансляционных и механистических исследований в рамках программ НИОКР.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях трансляционного контроля.
- Операционная ценность: стандартизирует рабочие процессы экстракции, фракционирования и детекции для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшего продолжения разработки (go/no-go), выявляя «узкие места» трансляции и поддерживая экономически эффективную сортировку портфеля проектов.
- Влияние на портфель: обеспечивает приоритизацию мишеней и моделей с учетом рисков на основе точности трансляции.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области биологии рибосом и методов фракционирования в градиенте.
- Необходим доступ к оборудованию для ультрацентрифугирования и измерению УФ-поглощения.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами для получения воспроизводимых результатов.
- Метод может быть адаптирован для систем дрожжей и млекопитающих с внесением необходимых модификаций в протокол.
- Целостность образцов и условия отсутствия РНаз имеют решающее значение для получения достоверных результатов.
