Эукариотические Polyribosome Анализ профиля
15 июня 2010 г.
В этой статье описывается протокол для извлечения переводе рибосом из эукариотических клеток. После извлечения, рибосомы разделены на monosomes и полирибосом сахарозы фракционирования градиент чтобы позволить различным рибосомных популяций для анализа. Таким образом, этот метод является золотым стандартом для изучения регуляции трансляции.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы отделить и сравнить монозонные и полирибосомные фракции из клеточных лизатов. Это достигается путем предварительного культивирования интересующих клеток. Вторым этапом процедуры является приготовление лизата клеток.
Третьим этапом процедуры является центрифугирование лизата через градиент сахарозы. Заключительным этапом процедуры является фракционирование градиента и визуализация различных рибосомных популяций с помощью УФ-следа. В конечном счете, можно получить результаты, которые показывают изменения в трансляции в различных экспериментальных условиях с помощью анализа профиля полирибосом.
Здравствуйте, я Энтони Эспозито из лаборатории доктора Терри Госса Кинси на кафедре молекулярной генетики, микробиологии и иммунологии в UMD и Медицинской школе Роберта Вуда Джонсона. А я Маркус Льюис. Также из лаборатории McKinsey здесь, в R-W-J-M-S.
Сегодня мы покажем вам процедуру анализа полирибосом. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения изменений и синтеза белка, которые возникают в результате мутаций или факторов окружающей среды. Итак, приступим. Сахароза.
Градиенты следует готовить за один день до использования, чтобы градиенты стали непрерывными. Смешайте соответствующие объемы 7% и 47% исходных растворов сахарозы с получением 48 миллилитров каждой из следующих концентраций сахарозы, 7%, 17%, 27%, 37% и 47%. Добавьте по одному молярному DTT к каждому раствору сахарозы до конечной концентрации в один миллимоляр. Для того чтобы залить градиенты, прикрепите пипетку для пасты к шприцу объемом 20 миллилитров, закрепив и запечатав пара-пленкой.
Добавьте семь миллилитров 7% сахарозы на дно пробирки для ультрацентрифуги размером один дюйм на 3,5 дюйма. Затем добавьте семь миллилитров 17%-ного раствора сахарозы под 7%-ный раствор, медленно поместив наконечник пипетки для пасты на дно пипетки-пробирки. На заливку каждого слоя должно уйти не менее 20 секунд.
Повторите с семью миллилитрами 27%, 37% и 47% растворов сахарозы, когда градиент засверлит. Вы должны наблюдать четкие линии между слоями, указывающие на то, что произошло минимальное перемешивание. Храните все градиенты в четыре градуса Цельсия на ночь вместе с роторами, бутылками и пробирками, которые будут использоваться для сбора образцов.
Чтобы получить экстракты из дрожжевых клеток, начните с выращивания ста 25 миллилитров дрожжевой культуры до наружного диаметра 600 в соотношении 0,8 к одному. Добавьте циклохейде в культуру до конечной концентрации 100 микрограмм на миллилитр и продолжайте встряхивать при температуре 30 градусов Цельсия в течение 15 минут. Через 15 минут пересыпьте культуру в бутылку центрифуги объемом 250 миллилитров и залейте льдом.
Держите все на льду, начиная с этого момента, центрифугируйте при 8 000-кратном весе в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Восстановите, суспензируйте гранулу в 10 миллилитрах льда, холодно лизисите, буферизуйте и переложите в 15 миллилитровые полипропиленовые трубки. Центрифугируйте при 5, 900-кратном течении силы тяжести в течение трех минут при четырех градусах Цельсия.
Суспендируйте гранулу в 0,5 миллилитрах лизисного буфера. Переложите суспензию в микропробирку объемом 1,5 миллилитра, а затем добавьте 0,5 миллилитра охлажденной обожженной кислоты промытых стеклянных шариков. Делайте вихревые движения клеток в течение четырех 32-х интервалов, вызывая трубку на льду в течение 30 секунд между каждым интервалом.
Затем добавьте еще 0,5 миллилитров буфера для лизиса в центрифугу объемом 1,5 000 миллилитров в 5 000 раз. Сила тяжести в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугируйте на максимальной скорости в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Наконец, перенесите супинат в новую микроцентрическую пробирку объемом 1,5 миллилитров. Экстракт можно хранить при температуре минус 80 градусов Цельсия для переноса лизата в градиент сахарозы. Приложите кончик пипетки к стенке пробирки у поверхности градиента и аккуратно нанесите лизат поверх градиента.
Для градиента в 35 миллилитров обычно загружается 500 микролитров лизата. С помощью щипцов осторожно опустите градиент в ведро качающегося ротора. Центрифугируйте градиенты при 100 000-кратном течении силы тяжести в течение четырех часов при четырех градусах Цельсия.
Примерно за 30 минут до завершения четырехчасового спина. Прикрепите иглу к проколу трубки и прикрепите ручку к онлайн-монитору абсорбционной флуоресценции. Включите питание монитора абсорбции, чтобы обеспечить достижение стабильного базового уровня перед анализом образцов.
Электронный сбор данных профиля PolyZone может быть легко получен в режиме реального времени, если прикрепить блок сбора данных DI 1 48 U. Чтобы в самописец был заправлен шприц-насос 50 миллилитрами флориновых орехов, используя быструю настройку обратного потока. Следите за тем, чтобы в нем не было пузырьков воздуха.
Подсоедините шланг от шприца к трубке пирсера. И кратковременно включить поток Flo инертно со скоростью шесть миллилитров в минуту в прямом направлении. Чтобы очистить шланг от пузырьков воздуха, поместите ряд трубок под шланг в конце проточной ячейки для сбора стока пробы.
Подготовьте ведро со льдом с предварительно сформированной лункой для хранения центрифужной пробирки, содержащей градиент сахарозы. Когда четырехчасовое центрифугирование будет завершено, осторожно извлеките пробирки центрифуги из ротора центрифуги и положите их на лед. Следите за тем, чтобы не нарушить градиенты.
Чтобы проанализировать клеточные экстракты, поместите градиентную трубку на пробирку, подсоедините верхнюю часть пробирки к выходному отверстию и закрепите. Поднимите нижнюю ступень к центрифужной трубке так, чтобы игла проткнула дно пробирки. Начните подачу Florin alert в прямом направлении со скоростью шесть миллилитров в минуту.
Как только флейта начнет поступать в трубку, следите за движением иглы на онлайн-мониторе поглощения ультрафиолета. Как только стрелка начнет двигаться, включите движение графика на скорость 60. Когда будет достигнут конец профиля полирибосомы, выключите подачу инертного Flo в центрифужную трубку и остановите движение графика на мониторе абсорбционной флуоресценции.
Втяните инертный Flo из центрифужной пробирки в шприц, начав поток в обратном направлении с высокой скоростью, следя за тем, чтобы сахароза не втягивалась из пробирки в шприц. Открутите пробирку центрифуги от прокалывателя пробирки, опустите иглу и извлеките пробирку. Здесь показан репрезентативный след экстракта рибосомы, полученного из дрожжей в присутствии циклохейда.
Указаны пики поглощения УФ-излучения, содержащие полирибосомы и рибосомы A TS 60 s и 40 s. Мы только что показали вам, как выполнить полирибосомный анализ при выполнении этой процедуры. Важно помнить, что нужно работать быстро, сохраняя образцы холодными и свободными от РНК.
Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Обзор
В данной статье описывается протокол экстракции транслирующих рибосом из эукариотических клеток, позволяющий проводить анализ различных популяций рибосом. Метод основан на разделении рибосом на моносомы и полирибосомы с помощью фракционирования в сахарозном градиенте, что имеет решающее значение для изучения регуляции трансляции.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Генетика
Теоретические основы
- Понимание функций рибосом имеет решающее значение для изучения синтеза белков.
- Полисомный профиль позволяет получить представление о регуляции трансляции.
- Методы экстракции рибосом являются основополагающими в исследованиях по молекулярной биологии.
- Факторы окружающей среды и мутации могут изменять синтез белков.
Цель исследования
- Разделение и сравнение фракций моно- и полирибосом из клеточных лизатов.
- Визуализация различных популяций рибосом с помощью УФ-детектирования.
- Анализ изменений трансляции при различных экспериментальных условиях.
Используемые методы
- Культивирование эукариотических клеток и подготовка клеточных лизатов.
- Центрифугирование в градиенте сахарозы.
- Фракционирование градиента для выделения популяций рибосом.
- Визуализация рибосомальных профилей с помощью мониторинга УФ-поглощения.
Основные результаты
- Успешное разделение моносом и полирибосом.
- Четкая визуализация популяций рибосом с помощью УФ-детектирования.
- Анализ регуляции трансляции при различных условиях.
- Изучение влияния мутаций на синтез белков.
Выводы
- Данный протокол является «золотым стандартом» для изучения регуляции трансляции.
- Он позволяет исследователям эффективно анализировать рибосомальную динамику.
- Полученные результаты способствуют пониманию молекулярных механизмов трансляции.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Анализ профилей полирибосом позволяет биофармацевтическим группам исследовать механизмы трансляционного контроля и выявлять дефекты синтеза белков на критических этапах поиска новых лекарственных средств. Этот метод дает количественное представление о глобальной и транскрипт-специфичной трансляции, что повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней и снижении механистических рисков. Его адаптивность к различным эукариотическим системам обеспечивает широкую применимость для портфеля ранних этапов НИОКР и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить прямую оценку трансляционной регуляции при генетических или средовых воздействиях.
- Обеспечивает механистическую проверку гипотез путем разграничения дефектов инициации и элонгации/терминации.
- Способствует функциональной валидации мишеней за счет количественного определения изменений соотношения полирибосом и моносом.
- Предоставляет платформу для оценки влияния потенциальных терапевтических воздействий на синтез белка.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированные количественные показатели связывания рибосом для стандартизации анализа.
- Позволяет осуществлять воспроизводимое фракционирование и УФ-детектирование популяций рибосом.
- Обеспечивает подготовку биологических экстрактов, подходящих для последующего анализа мРНК или белков.
- Поддерживает скрининг соединений, модулирующих аппарат трансляции или регуляторные пути.
Трансляционные и доклинические исследования
- Связывает поиск трансляционных биомаркеров с пониманием механизмов регуляции синтеза белка.
- Обеспечивает преемственность от клеточных моделей к доклиническим системам путем адаптации протоколов для различных видов эукариот.
- Позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков, выявляя трансляционные дефекты, связанные с моделями заболеваний.
- Обеспечивает понимание механизмов, лежащих в основе фенотипов, наблюдаемых в ходе доклинических исследований.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Полирибосомное профилирование интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, позволяя проводить проверку гипотез в отношении трансляции, что способствует как валидации мишеней, так и поиску перспективных соединений.
- Биология открытий: позволяет количественно оценить выход трансляции и выяснить специфические для конкретного пути регуляторные механизмы.
- Скрининг: обеспечивает надежное количественное фракционирование и данные УФ-абсорбции для подготовки анализа.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение популяций рибосом в режиме реального времени для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает клеточные и доклинические модели, позволяя адаптировать протоколы и согласовывать биомаркеры.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократная платформа для различных трансляционных и механистических исследований в рамках программ НИОКР.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях трансляционного контроля.
- Операционная ценность: стандартизирует рабочие процессы экстракции, фракционирования и детекции для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшего продолжения разработки (go/no-go), выявляя «узкие места» трансляции и поддерживая экономически эффективную сортировку портфеля проектов.
- Влияние на портфель: обеспечивает приоритизацию мишеней и моделей с учетом рисков на основе точности трансляции.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области биологии рибосом и методов фракционирования в градиенте.
- Необходим доступ к оборудованию для ультрацентрифугирования и измерению УФ-поглощения.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами для получения воспроизводимых результатов.
- Метод может быть адаптирован для систем дрожжей и млекопитающих с внесением необходимых модификаций в протокол.
- Целостность образцов и условия отсутствия РНаз имеют решающее значение для получения достоверных результатов.
