Нильское красное окрашивание C. elegans: метод визуализации липидных капель у неподвижных животных
JoVE Encyclopedia of Experiments
Биология
0 просмотров • 3:34 мин • April 30th, 2023
- При визуализации липидных капель, внутриклеточных органелл, хранящих нейтральные липиды, начинают с добавления в образец раствора детергента, например, содержащего Triton X-100. Это пропитает клетки червя. Далее фиксируют пробу в соответствующей концентрации изопропанола, например 40%.
Затем добавьте в образец красную нил и беречь его от света, так как краситель светочувствительный. Фиксация позволяет красителю получить доступ к липидным каплям по всему животному. Нильский красный — липофильный краситель, спектр излучения флуоресценции которого зависит от полярности локальной липидной среды.
При воздействии полярных липидов, таких как фосфолипиды, спектр излучения Nile Red находится в более высоких, красных длинах волн. При воздействии нейтральных липидов, таких как триацилглицерины и сложные эфиры стеринов в нейтральном ядре липидных капель, спектр излучения Nile Red смещается в сторону более низких, желто-золотых длин волн.
Поэтому используйте зеленый канал флуоресцентного микроскопа, который будет собирать излучения желто-золотой длины волны, чтобы визуализировать окрашивание липидных капель в красный цвет Нила по всему животному. В примере протокола мы увидим процедуру окрашивания в красный цвет Нила и визуализацию липидных капель в фиксированных образцах.
- Для проведения окрашивания липидов Nile Red пластинчатые черви на среде роста нематоды (NGM), засеянной поздней log OP50 E. coli, и выращивание червей при температуре 20 градусов Цельсия до ранней стадии L4. Промойте червей 1 миллилитром раствора PBST и переложите суспензию червя в микропробирку объемом 1,5 миллилитров.
Центрифугируйте червей при 560-кратном давлении в течение одной минуты, затем удалите надосадочную жидкость и повторяйте промывку PBST до тех пор, пока кишечная палочка не будет очищена от суспензии. Далее к грануле червя добавьте 100 микролитров 40% изопропанола, или 60% для окрашивания ОРО, и инкубируйте образец при комнатной температуре в течение трех минут.
- Добавление изопропанола имеет решающее значение для правильной пеабилизации червей перед окрашиванием.
- Центрифугируйте черви при гравитации, в 560 раз превышающей силуэт, в течение одной минуты и удалите надосадочную жидкость, не нарушая гранулу червя.
- Важно свести к минимуму воздействие света на этапах центрифугирования.
- Теперь, находясь в темноте, добавьте в каждый образец по 600 микролитров предварительно приготовленного рабочего раствора NR. Переверните трубки три раза и полностью перемешайте червей и раствор. Затем выдержите образец в темноте при комнатной температуре в течение двух часов.
После инкубации центрифугируйте червей и удалите надосадочную жидкость. Затем добавьте 600 микролитров PBST и инкубируйте образцы в темноте в течение 30 минут, чтобы удалить излишки NR пятна. После повторного вращения образцов, как и раньше, удалите все надсадочную жидкость, кроме примерно 50 микролитров.
Обзор
В данной статье подробно описан протокол визуализации липидных капель у нематод с помощью окрашивания нильским красным. Метод включает пермеабилизацию клеток, фиксацию образцов и использование флуоресцентной микроскопии для наблюдения за липидными каплями.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Биохимия
Теоретическая часть
- Липидные капли представляют собой внутриклеточные органеллы для хранения нейтральных липидов.
- Нильский красный (Nile Red) — это липофильный краситель, используемый для окрашивания липидов.
- Флуоресценция красителя изменяется в зависимости от липидного окружения.
- Правильная фиксация и пермеабилизация имеют решающее значение для эффективного окрашивания.
Цель исследования
- Визуализация липидных капель у нематод.
- Демонстрация использования Nile Red для окрашивания липидов.
- Предоставление детального протокола для исследователей.
Используемые методы
- Подготовка нематод на питательной среде.
- Промывка и центрифугирование образцов червей.
- Фиксация изопропанолом для пермеабилизации.
- Окрашивание Nile Red и последующая визуализация.
Основные результаты
- Успешная визуализация липидных капель с помощью флуоресцентной микроскопии.
- Демонстрация изменений спектра эмиссии Nile Red в зависимости от типа липидов.
- Эффективность протокола подтверждена воспроизводимыми результатами.
- Подчеркнута важность минимизации воздействия света во время процедуры.
Выводы
- Нильский красный является эффективным инструментом для визуализации липидных капель.
- Правильная подготовка образцов имеет решающее значение для получения точных результатов.
- Данный протокол может быть полезен для дальнейших исследований липидного обмена.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Окрашивание нильским красным позволяет визуализировать липидные капли в модельных организмах, что способствует валидации мишеней в исследованиях метаболических заболеваний. Данный метод предоставляет количественные данные о распределении липидов, которые помогают снизить риски при проверке механизмов терапевтических гипотез. Такой подход повышает прогностическую уверенность на ранних этапах поиска лекарств, связывая фенотипические изменения липидов с модуляцией соответствующих путей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем визуализации накопления нейтральных липидов в ядрах липидных капель.
- Практическая ценность: обеспечивает снижение биологических рисков за счет прямого наблюдения органелл хранения липидов в фиксированных образцах.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля исследований путем корреляции фенотипов липидных капель с генетическими воздействиями или воздействием соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений, модулирующих липидный обмен.
- Количественный выход: Получение данных о содержании липидов на основе флуоресценции, что позволяет стандартизировать анализ.
- Масштабируемость: Обеспечение воспроизводимой визуализации липидов в нескольких образцах для повторного использования платформы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Связывает фенотипы липидных капель с моделями метаболических заболеваний у C. elegans.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает переход от первичных наблюдений к доклинической валидации липидного обмена.
- Решения с учетом рисков: Определяет критерии дальнейшего продвижения исследования на основе изменений распределения липидов в системах, релевантных для данных заболеваний.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска, предоставляя данные о липидном фенотипе, которые используются на этапах валидации мишеней и идентификации соединений-лидеров.
- Открытия в биологии: Поддерживает проверку гипотез о путях липидного обмена посредством прямой визуализации липидных капель.
- Скрининг: Позволяет разрабатывать анализы для соединений, влияющих на накопление липидов, с использованием стандартизированной фиксации и окрашивания.
- Аналитика: Обеспечивает количественные показатели флуоресценции в зеленом канале для сравнения содержания липидов при различных условиях.
- Трансляционные исследования: Связывает изменения липидных капель с доклинической преемственностью через консервативные механизмы липидного обмена.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу для визуализации липидов, применимую для множества штаммов нематод и различных условий.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в фенотипах накопления липидов.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость за счет протоколов с фиксированным объемом образцов и контролируемого использования красителей.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go), предоставляя липидные фенотипические маркеры для метаболических мишеней.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию соединений с учетом рисков на основе эффективности модуляции липидных капель.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с флуоресцентной микроскопией и биологией липидов для точной интерпретации спектра.
- Необходимо оборудование, способное регистрировать эмиссию в зеленом канале для визуализации нейтральных липидов, окрашенных Nile Red.
- Требуется межкомандная стандартизация процедур фиксации, пермеабилизации и контроля воздействия света.
- При применении метода к различным модельным системам или типам липидов следует учитывать необходимость адаптации протокола.
- Существуют практические ограничения, такие как светочувствительность красителя и зависимость доступности мишеней от правильной фиксации образцов.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Биохимические и высокая пропускная способность Микроскопическая оценка жировой массы в
Похожие видео
0 Просмотры
Выращивание зеленых микроводорослей в фотобиореакторах колонки пузыря и Assay для нейтральные липиды
Похожие видео
0 Просмотры
Флуоресценция основе анализа для характеристики и количественной оценки образования липидных капель в кишечных органоидов человека
Похожие видео
0 Просмотры
Визуализация Caenorhabditis Elegans Кутикулы структур с помощью липофильных Vital краска, DII
Похожие видео
0 Просмотры
Окрашивание нильским красным: метод обнаружения и количественного определения внутриклеточных нейтральных липидов в водорослях
Похожие видео
0 Просмотры
C. elegans кишечника как модель для межклеточных люмен морфогенеза и In Vivo поляризованной мембраны биогенеза на уровне одной ячейки: маркировка Пятнать антитела, RNAi потери функции анализа и обработки изображений
Похожие видео
0 Просмотры
Количественное определение липидного изобилия и оценки распределения липидов в Caenorhabditis elegans Нила красный и нефти красный O пятнать
Похожие видео
0 Просмотры
Рассечение и Липид капли пятно Эноцитов в Drosophila Larvae
Похожие видео
0 Просмотры
Безметчная визуализация динамики накопления липидов у caenorhabditis elegans с использованием стимулированной рамановской рассеянной микроскопии
Похожие видео
0 Просмотры
Анализ флуоресцентно окрашенных липидных капель с 3D-реконструкцией для оценки стеатоза печени
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026