$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- При визуализации липидных капель, внутриклеточных органелл, хранящих нейтральные липиды, начинают с добавления в образец раствора детергента, например, содержащего Triton X-100. Это пропитает клетки червя. Далее фиксируют пробу в соответствующей концентрации изопропанола, например 40%.
Затем добавьте в образец красную нил и беречь его от света, так как краситель светочувствительный. Фиксация позволяет красителю получить доступ к липидным каплям по всему животному. Нильский красный — липофильный краситель, спектр излучения флуоресценции которого зависит от полярности локальной липидной среды.
При воздействии полярных липидов, таких как фосфолипиды, спектр излучения Nile Red находится в более высоких, красных длинах волн. При воздействии нейтральных липидов, таких как триацилглицерины и сложные эфиры стеринов в нейтральном ядре липидных капель, спектр излучения Nile Red смещается в сторону более низких, желто-золотых длин волн.
Поэтому используйте зеленый канал флуоресцентного микроскопа, который будет собирать излучения желто-золотой длины волны, чтобы визуализировать окрашивание липидных капель в красный цвет Нила по всему животному. В примере протокола мы увидим процедуру окрашивания в красный цвет Нила и визуализацию липидных капель в фиксированных образцах.
- Для проведения окрашивания липидов Nile Red пластинчатые черви на среде роста нематоды (NGM), засеянной поздней log OP50 E. coli, и выращивание червей при температуре 20 градусов Цельсия до ранней стадии L4. Промойте червей 1 миллилитром раствора PBST и переложите суспензию червя в микропробирку объемом 1,5 миллилитров.
Центрифугируйте червей при 560-кратном давлении в течение одной минуты, затем удалите надосадочную жидкость и повторяйте промывку PBST до тех пор, пока кишечная палочка не будет очищена от суспензии. Далее к грануле червя добавьте 100 микролитров 40% изопропанола, или 60% для окрашивания ОРО, и инкубируйте образец при комнатной температуре в течение трех минут.
- Добавление изопропанола имеет решающее значение для правильной пеабилизации червей перед окрашиванием.
- Центрифугируйте черви при гравитации, в 560 раз превышающей силуэт, в течение одной минуты и удалите надосадочную жидкость, не нарушая гранулу червя.
- Важно свести к минимуму воздействие света на этапах центрифугирования.
- Теперь, находясь в темноте, добавьте в каждый образец по 600 микролитров предварительно приготовленного рабочего раствора NR. Переверните трубки три раза и полностью перемешайте червей и раствор. Затем выдержите образец в темноте при комнатной температуре в течение двух часов.
После инкубации центрифугируйте червей и удалите надосадочную жидкость. Затем добавьте 600 микролитров PBST и инкубируйте образцы в темноте в течение 30 минут, чтобы удалить излишки NR пятна. После повторного вращения образцов, как и раньше, удалите все надсадочную жидкость, кроме примерно 50 микролитров.