Хронический изображений Мыши зрительной коры Использование тоньше черепа-подготовка

Дендритные шипики представляют собой мембранные выступы из дендрита нейрона, которые получают синаптический вход. Удлинение, уменьшение или исчезновение шипов происходит в ответ на изменения в функции нейронной сети, которые являются результатом определенных паттернов нейронной активности. Это явление известно как корковая пластичность для наблюдения за морфологическими изменениями в дендритных шипах.

У живых животных к черепу мыши прикрепляется пластина для визуализации. Область черепа истончается хирургическим путем, и требуются изображения с низким и большим увеличением. Затем области повторно визуализируются в более поздние моменты времени.

Полученные результаты показывают, что морфология дендритного отростка может быть четко визуализирована с помощью тонкого препарирования черепа в нескольких временных точках. И эта морфология позвоночника очень пластична, демонстрируя изменения в структуре, а также появление и исчезновение дендритных шипиков. Здравствуйте, меня зовут Эмили Келли, я работаю в лаборатории Анайи Мака на факультете нейробиологии и анатомии Рочестерского университета.

Сегодня мы покажем вам процедуру хронической визуализации коры флакона мыши после того, как плавники называются препарированием. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения дендритного оборота позвоночника. Итак, приступим.

Начните процедуру со стерилизации инструментов для асептической хирургии. Затем простерилизуйте рабочее место с использованием этанола 70% и накройте рабочую поверхность чистой повязкой. Контролируйте глубину анестезии у мыши, находящейся под наркозом фентанилового коктейля, проверяя ее реакцию на ущипывание пальца ноги. Изображенная здесь мышь является трансгенной мышью A-G-F-P-M, у которой экспрессируется GFP.

В слое пять параметаллические клетки, которые проецируют дендритные процессы в поверхностные слои. Чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37,5 градусов по Цельсию, положите животное на греющее одеяло и следите за ним с помощью прилагаемого ректального термометра. Затем нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить их пересыхание с помощью ножниц.

Удалите шерсть с затылка мыши, из-за ушей к глазам. Затем очистите макушку головы животного с помощью 70% этанола, после чего добавьте скраб Бетадина и раствор Бетадина. Сделайте разрез LCU за ушами и вверх по правой или левой стороне средней линии, в зависимости от того, какое полушарие будет визуализировано для глаз, согните кожу над местом операции и в сторону от места операции.

Не снимайте кожу, так как позже она будет зашита с помощью тонких щипцов. Аккуратно потяните кожу вверх и в сторону от интересующей области. С помощью чистых щипцов аккуратно соскребите надкостницу с оголенной области черепа.

Нанесите небольшое количество 10% чистого хлорида на череп, чтобы полностью высушить мембрану надкостницы и убедиться, что она была полностью удалена. Важно, чтобы череп был полностью сухим. Чтобы обеспечить правильное прилегание клея, аккуратно соскребите засохшую мембрану надкостницы микрохирургическим лезвием.

Затем нанесите тонкий слой акрилового клея Sano вокруг окна визуализации головной пластины из нержавеющей стали и прикрепите пластину к черепу. Деревянным концом ватной палочки нанесите клей на внутренние швы окна визуализации, убедившись, что заполнены все зазоры между пластиной визуализации и кривизной черепа. Поместите каплю ускорителя клея в окно.

Затем быстро вытрите излишки. Дайте клею высохнуть, как только клей полностью высохнет. С помощью бормашины, прикрепленной к жернову из нержавеющей стали диаметром 0,7 миллиметра, начните утончать череп в окне визуализации.

Чередуйте сверление с периодическим применением 0,9% стерильного физиологического раствора. Чтобы избежать выделения слишком большого тепла на череп. Утончите окошко четыре на четыре миллиметра на черепе с помощью небольших штрихов по поверхности черепа.

С помощью бормашины. Проверьте тонкость черепа тупыми концевыми щипцами. Поверхность черепа будет слегка углубляться при легком надавливании.

Оптимальная толщина черепа для визуализации составляет от 10 до 30 микрон. Как только череп истончится, очистите окно от всего мусора и нанесите на череп солевой раствор. Сфотографируйте окно визуализации с помощью цифровой камеры, установленной на препарирующем прицеле.

Сосудистая сеть головного мозга на этой фотографии поможет определить положение для размещения пластины для визуализации для последующих сеансов визуализации. Транспортируйте животное в двухфотонную установку. Животное должно оставаться на нагревательном одеяле, а температура тела должна постоянно контролироваться на протяжении всего сеанса визуализации.

Двухфотонный микроскоп с лазером mi tai. Используется твердотельный насос мощностью 10 Вт для максимальной мощности и модифицированный конфокальный блок обзора потока Olympus. Система оптимизирована для визуализации глубоких тканей, а внешние детекторы установлены максимально близко к объективу, чтобы обеспечить максимальное обнаружение флуоресценции от мозга, добавить каплю физиологического раствора в окно визуализации с помощью малого цифрового зума.

Определите область, содержащую ярко помеченные нейроны, с помощью цифровой камеры, закрепленной на микроскопе. Ips, сфотографируйте область съемки. Это необходимо для возврата к тому же месту получения изображения в последующий момент времени.

Получите стек с малым увеличением по всей видимой площади мозга, показывающий степень разветвления дендритов. Это будет использоваться для определения местоположения области визуализации в последующих временных точках как кровеносных сосудов, так и дендритов. Поддерживайте их структуру у молодых и взрослых животных с помощью программного обеспечения для визуализации.

Увеличьте цифровое увеличение в восемь раз, при необходимости отрегулируйте координаты XY и соберите стек с большим увеличением, который покажет подробную морфологию дендритов, включая расположение и структуру дендритных шипов. Делайте подробные заметки о каждой коллекции стека, включая координаты панорамирования, диапазон сбора, размер шага Z и количество шагов в стеке. Эти заметки будут использованы при возвращении к этому дендри или аксону в последующий момент времени.

После визуализации снимите пластину головы, аккуратно отделив ее от поверхности черепа. С помощью щипцов. Удалите остатки клея и протрите череп 0,9% стерильным физиологическим раствором.

Сшить кожу над черепом вместе с помощью шовной нити номер шесть. Протрите область с содержанием этанола 70% после процедуры визуализации. Поместите животное в чистую клетку под тепловую лампу до тех пор, пока оно не проснется и не станет подвижным.

Затем верните животное в исходную клетку, чтобы снова сфотографировать животное через два дня или много месяцев, снимите швы и снова откройте кожу на голове. Используя асептические методы, используйте цифровое изображение сосудистой сети головного мозга, полученное во время первой операции, чтобы определить исходное место визуализации. Затем снова зафиксируйте пластину для головы, как и раньше.

При необходимости с помощью микрохирургического лезвия аккуратно истончите любую кость, которая могла вновь вырасти между временными точками визуализации. Протоните с помощью бормашины, очистите окно визуализации от мусора и нанесите каплю 0,9% стерильного физиологического раствора. Поднесите животное к двухфотонному микроскопу и определите местоположение исходной области визуализации с помощью цифрового флуоресцентного изображения, полученного во время предыдущего сеанса.

Запустите программу просмотра потока. Откройте исходное изображение с малым увеличением, прикрепите прозрачный лист к экрану компьютера и нарисуйте рисунок основных кровеносных сосудов с помощью прозрачного пера. Затем откройте живое изображение и выровняйте кровеносную сосудистую сеть в соответствии с нарисованным узором на прозрачной пленке.

Удалите прозрачность, чтобы повторно отобразить структуры с восьмикратным увеличением. Откройте нужную стопку, собранную во время предыдущего сеанса работы с образами. Нарисуйте конструкцию на прозрачной пленке, прикрепленной к экрану компьютера.

Увеличьте изображение в восемь раз относительно живого изображения и выровняйте изображение по прозрачности. В зависимости от точности выравнивания места с малым увеличением, может потребоваться также немного отрегулировать угол изображения, установить координаты панорамирования в соответствии с параметрами первого дня визуализации, включая размер шага и количество собранных изображений, повторное изображение Зака может быть выполнено дважды. Количество вскрытий кожи головы должно быть ограничено, чтобы избежать нарушения целостности черепа, что приведет к низкому разрешению изображения у мышей, экспрессирующих GFPM.

Подмножество параметаллических клеток пятого слоя и соответствующие дендритные процессы были визуализированы с помощью двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии in vivo, здесь показаны дендриты зрительной коры, меченные GFP. Это изображение представляет собой проекцию одного изображения, полученного каждые пять микрон с PIA на конечную глубину 175 микрон. Квадратная область показана при большем увеличении здесь в нулевой день, и снова на четвертый день здесь, при более высоком увеличении изображения дендритной ветви в нулевой и четвертый день сравнивается.

Эти изображения демонстрируют стабильные шипы, обозначенные белыми наконечниками стрелок, утраченные втягивающие шипы, которые отмечены красным наконечником стрелы, и новые шипы, обозначенные зеленым наконечником стрелы. Мы только что показали вам, как выполнить хроническую двухфотонную визуализацию в зрительной коре головного мозга мыши с использованием тонкого препарата черепа. При выполнении этой процедуры важно помнить об особой осторожности в процессе истончения, чтобы избежать повреждения черепа и нижележащей твердой мозговой оболочки, так как это приведет к плохому разрешению изображения, и делать подробные заметки.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.