Генома анализа с использованием чип-изоформы Определить конкретные цели Гена

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы определить геномные мишени KDM пять, один Джареда, RBB, два гистондеметилазы. Это достигается путем получения сшитого хроматина, который подвергается ультразвуковой обработке для получения фрагментов ДНК соответствующего размера в качестве второго этапа. Два связанных фрагмента ДНК RBB представляют собой иммуноципитацию с антителами RBB two.

Далее восстановленная геномная ДНК амплифицируется с помощью ПЦР для секвенирования. Наконец, секвенированные Illumina короткие чтения однозначно выровнены с геномом человека, а значимые пики идентифицируются и аннотируются с ближайшими генами. Для идентификации двух генов-мишеней были получены результаты, которые показывают молекулярные функции, связанные с двумя генами-мишенями Rrb B, на основе полногеномной идентификации двух обогащенных областей Rbbb.

Привет, меня зовут Майк. Она из лаборатории доктора Элизабет Бенсиа на кафедре биохимии и молекулярной генетики Университета Иллинойса в Чикаго. И я из лаборатории биомедицинской геномики под руководством доктора NGA в Парке биомедицинских исследований BARCEL University PO P fea.

А меня зовут Даниэль Дал. А меня зовут Уильям Рихтер. Мы оба также учимся в Лаборатории Навыков Доброжелательности.

Сегодня мы покажем вам процедуру хроматина, иммунопреципитации и секвенирования. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения места связывания своего дерматолога. Итак, приступим.

Чтобы начать эту процедуру, выращивают примерно от 10 до восьмой клеток. Для каждой иммунопреципитации или ип. Здесь диффузная остеолитическая лимфома.

U 9 37 клеток используют и индуцируют для моноцитарной дифференцировки с помощью ТФА в течение 96 часов после роста клеток в растворе формальдегида непосредственно в среду до конечной концентрации 1%, затем кратковременно взбалтывают колбу и дают ей постоять при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем аспирируйте среду и промойте клетки 15 миллилитрами ледяного PBS. Повторите эту стирку один раз.

Далее добавьте шесть миллилитров лизисного буфера по одному в каждую из колб со льдом. Затем раскачайте колбы в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Наконец, соберите клетки с помощью скребка для клеток и перенесите их в конические пробирки объемом 15 миллилитров.

На этом этапе элементы могут храниться при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Если клетки были заморожены, выгните их. После размораживания раскрутите ячейки вниз и выбросьте сна.

Затем повторно суспендируйте клетки в шести миллилитрах лизисного буфера два, осторожно покачайте трубки при комнатной температуре в течение 10 минут. Повторите центрифугирование и ресуспендируйте клетки в 2,5 миллилитрах лизисного буфера три. Затем подготовьте суспензию к ультразвуку, поместив ее в стакан с ледяной водой с микронаконечником соника Branson 450, установленным на амплитуду от 50 до 60%.

Обработайте раствор ультразвуком для 32-го постоянного всплеска и охладите на льду. В течение одной минуты повторяйте эти импульсы от 10 до 15 раз, затем пипеткой передавайте содержимое пробирки вверх и вниз и переносите его в новую пробирку. Продолжайте пульсировать и охлаждать раствор.

Еще пять раз после ультразвуковой обработки добавьте 10% Triton X 100 к одной 10-й объема раствора. Затем переложите лизаты в центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра и выкрутите мусор в микроцентрифуге перед хроматином, иммунопреципитацией или чипом. Сохраните 50 микролитров клеточного лизата в качестве входного образца.

Затем соединили очищенный лизат клеток с шариками дины, связанными с антителами, которые были предварительно приготовлены, как описано в письменном протоколе. Взбейте смесь в дополнение к входному образцу объемом 50 микролитров при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. Промойте шарики одним миллилитром буфера для стирки.

Затем с помощью магнитной подставки соберите бусины и удалите надосадочную жидкость. Повторите эту стирку от шести до восьми раз. Выполните заключительную промывку одним миллилитром TE плюс 50 миллимолярами хлорида натрия.

Вращайте шарики в микроцентрифуге после центрифугирования, отсасывайте остатки TE-буфера. Затем добавьте к образцам 100 микролитров буфера elu. Сразу после.

Инкубируйте образцы при температуре 65 градусов Цельсия в течение 10–15 минут. Каждые две минуты поцарапывайте трубки о трубку объемом 1,5 миллилитров, чтобы шарики оставались во взвешенном состоянии. Соберите шарики с помощью центрифугирования и магнитного стенда и перенесите SNAT в ПЦР-пробирку.

Затем извлеките ранее сохраненный образец ввода и добавьте три объема буфера элюирования. Наконец, поместите IP и входные образцы в термоамплификатор на ночь при температуре 65 градусов Цельсия. Чтобы обратить перекрестные связи на следующий день, добавьте к образцам один объем буфера TE

Затем добавьте РНК А до конечной концентрации 0,2 мкг на микролитр. Инкубируйте образцы в термоамплификаторе в течение одного-двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации добавьте протеиназу К до конечной концентрации 0,2 мкг на микролитр.

Затем инкубируйте образцы в термоамплификаторе при температуре 55 градусов Цельсия в течение двух часов. Затем извлеките образцы один раз с помощью одного объема фенола. Извлеките образцы второй раз с помощью одного объема фенилхлороформа изоамилового спирта.

Наконец, извлеките образцы еще раз с помощью одного объема хлороформа изоамилового спирта. Затем добавьте по 30 микрограмм гликогена в каждый образец. Также добавьте в образцы хлорид натрия до конечной концентрации 0,2 моляра и два объема этанола.

Инкубируйте их в течение 30 минут при температуре минус 80 градусов по Цельсию. После инкубации открутите образцы и сцедите снэт. Промойте гранулы 500 микролитрами 75% этанола, затем высушите гранулы и повторно суспендируйте их в 40 микролитрах воды.

Чтобы проверить размеры фрагментов ДНК, полученных с помощью процедуры SONCATION, загрузите пять микрограммов очищенного входного образца в 1,8%-ный агрогель и запустите гель. Процедура ультразвуковой обработки должна производить фрагменты в диапазоне от 150 до 350 пар оснований. Однако, если фрагменты не попадают в этот диапазон, процедуру ультразвуковой обработки следует скорректировать, изменяя количество всплесков и амплитуду перед амплификацией геномной ДНК.

Проверьте размер, концентрацию и обогащение образцов, как описано в письменном протоколе. Чтобы начать амплификацию геномной ДНК, необходимо получить 34 микролитра образца ВП и 200 нанограммов входного образца. Выполнение и восстановление хвостового добавления и лигирования адаптеров к фрагментам ДНК с использованием набора для подготовки образцов геномной ДНК Illumina, как описано в письменном протоколе.

Очистите ДНК с помощью набора для очистки ПЦР mini lut, а затем разбавьте ее в буфере EB, который был предварительно нагрет до 50 градусов Цельсия. Используйте 23 микролитра и 46 микролитров для образцов ИП и входных образцов ДНК соответственно. Сделайте ПЦР-реакцию с использованием 23 микролитров ДНК с адаптерами, 25 микролитров термоядерного синтеза, ДНК-полимеразы из набора.

Один микролитр 20 микромолярной подошвы ПЦР один и один микролитр 20 микромоляров. Таким образом, ПЦР 2 запускает реакцию ПЦР, как описано в письменном протоколе, после амплификации ПЦР. Очистите ДНК с помощью набора для очистки ПЦР Qiagen mini loop

Предварительно подогрейте 15 микролитров буферного EB до 50 градусов Цельсия и разбавьте ДНК, разведите 0,5 микролитра образца от одного до четырех и выполните считывание NanoDrop для очистки амплифицированных продуктов. Приготовьте гель 1,8%AGROS объемом 50 миллилитров, используя воду класса ВЭЖХ, добавьте TAE и бромид после того, как агрос растает. Затем налейте гель, загрузите гель.

После добавления четырех микролитров загрузочного буфера на вход и IP образцы, затем запустите гель при напряжении 120 вольт в течение 45 минут. Анализируйте гель после его нанесения. Это должно показать, что образуются фрагменты в диапазоне от 150 до 350 пар оснований.

Они представляют собой фрагменты геномной ДНК длиной от 50 до 250 пар оснований. А адаптер вырезает область геля, содержащую материал в диапазоне от 150 до 350 пар оснований, с помощью скальпеля. Будьте осторожны, чтобы не исчерпать переходную полосу адаптера, которая проходит примерно на 120 пар оснований.

Восстановите ДНК с помощью набора для быстрой экстракции геля для каяка в соответствии с инструкциями производителя. Высушите образец ровно до 11 микролитров в обратном направлении без нагрева. Извлеките один микролитр образца и измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра NanoDrop.

Наконец, определите обогащенные продукты генов с помощью анализатора генома Illumina и проанализируйте сайты связывания и гены-мишени, как описано в письменном протоколе. Геномные координаты идентифицированных обогащенных RB-связывающих белков двух или RBP двух связывающих областей представлены в хромосомном формате. Занятость генов ансамбля в хромосомах может быть визуализирована в виде черных VAR.

Здесь показаны занятия хромосомы 10, две области связывания показаны вертикальными линиями. На средней панели показаны все две области связывания rbp с двумя изоформами на хромосоме 10, а на нижней панели показаны две большие области связывания изоформ. Эта информация дает представление о перекрывающихся и удельном заполнении двух изоформ RBP на хромосоме 10.

Здесь показана тепловая карта с частотой ложных открытий или скорректированная FDR значительно обогащенная онтология генов или категории молекулярных функций среди генов, связанных rbp. Два цвета в сторону красного указывают на высокую статистическую значимость. Желтый цвет указывает на низкую статистическую значимость, а серый — на отсутствие статистической значимости.

Анализ обогащения показывает перекрывающиеся и изоформные специфические молекулярные функции двух генов-мишеней R BP. Мы только что показали вам, как определить сайты связывания транскрипционного фактора во время этой процедуры. Важно получить фрагменты ДНК соответствующего диапазона размеров и выходов.

Этого можно достичь, следуя нашим рекомендациям на этапе SONCATION. Вот и все. Удачи в ваших экспериментах и спасибо за просмотр.