Внутрибрюшинного введения в взрослых данио рерио
30 августа 2010 г.
Мы демонстрируем внутрибрюшинного введения во взрослых рыбок данио. Мы используем 10 мкл NanoFil микрошприца контролируется Micro4 контроллер и UltraMicroPump III. Эта демонстрация включает в себя использование холодной воды в качестве анестезирующего средства.
Общая цель данной процедуры заключается в введении раствора в брюшную полость взрослой зебрафиш. В этом примере мы введем глюкозу в лабораторных условиях. Мы используем эту процедуру для изучения стаза глюкозы в крови.
Это осуществляется путем предварительного взвешивания рыбы для определения объема вводимого раствора на грамм массы тела. Вторым этапом процедуры является анестезия рыбы холодной водой. Третьим этапом процедуры является перенос рыбы на предметный столик микроскопа и проведение инъекции.
Заключительным этапом процедуры является возвращение рыбы в аквариум для восстановления. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие изменения в гомеостазе глюкозы путем измерения уровня глюкозы в крови. Здравствуйте, я Мэри Кинкл из лаборатории Виктории Принс кафедры биологии и анатомии организмов Чикагского университета.
Меня зовут Стефани Эймс, я также работаю в лаборатории Принса. Сегодня мы продемонстрируем процедуру внутрибрюшинного введения препаратов взрослым особия Zebrafish. В нашей лаборатории мы используем этот метод для изучения регуляции гомеостаза глюкозы в крови.
Приступим к работе. Для подготовки рыб к инъекции перенесите их в чистый аквариум и прекратите кормление. Голодание рыб должно длиться 24 часа для очистки содержимого кишечного пузыря и 72 часа для снижения уровня глюкозы в крови до базовых значений.
Плотность посадки, используемая в данном протоколе, составляет 10–12 особей смешанной по полу популяции рыб на девятилитровый аквариум с тремя слоями мраморной крошки; мраморная крошка изолирует икру, предотвращая ее поедание. Ежедневно удаляйте икру и продукты жизнедеятельности путем сифонирования аквариума.
Затем приготовьте солевой раствор Кортланда, используя 124,1 мМ NaCl, 5,1 мМ KCl, 2,9 мМ пирофосфата натрия, 1,9 мМ семиводного сульфата магния, 1,4 мМ дигидрата хлорида кальция, 11,9 мМ гидрокарбоната натрия, 4 г поливинилпирролона и 1000 USP единиц гепарина; доведите конечный объем до 100 мл деионизированной водой, отфильтруйте, стерилизуйте и храните при 4 °C. Далее растворите 5 г глюкозы в 10 мл солевого раствора Кортланда. Чтобы получить раствор глюкозы с концентрацией 0,5 мг/мкл, отфильтруйте, стерилизуйте и храните его при 4 °C.
Затем подготовьте операционный стол, обрезав мягкую губку так, чтобы её высота по плоской стороне составляла примерно 20 millimeter. Сделайте вырез глубиной от 10 до 15 millimeter для фиксации рыбы при инъекции. Поместите губку в чашку Петри диаметром 60 millimeter, а затем установите чашку Петри с губкой в крышку от коробки с наконечниками для дозатора P 200.
Затем подготовьте микроскоп, накрыв его основание пищевой пленкой и бумажными полотенцами для защиты. Чтобы предотвратить разливы, установите хирургический стол поверх бумажного полотенца. Предварительно настройте фокус, наведя объектив на хирургический стол и сфокусировавшись на губке.
Положите палец на губку и сфокусируйтесь на нем, чтобы минимизировать дальнейшую регулировку фокуса, когда рыба окажется на операционном столе. Затем взвесьте рыбу, наполнив стакан объемом 500 миллилитров примерно на одну треть водой из системы содержания рыб. Перенесите рыбу вместе с садком в стакан, стараясь оставить как можно меньше лишней воды, и зафиксируйте вес; каждую взвешенную рыбу перенесите в прозрачный промаркированный резервуар.
Рассчитайте объем инъекции в зависимости от веса. В данном примере будет вводиться раствор глюкозы в солевом растворе Кортланда в дозе 0,5 мг на грамм массы тела. Поскольку концентрация нашего раствора составляет 0,5 мг/µL, расчет выглядит следующим образом: вес рыбы в граммах, умноженный на один, равен объему инъекции в µL; подготовьте шприц и соответствующее оборудование для инъекций.
В данном протоколе используются стальная игла 30G с кососрезом, ультрамикронасос, микропроцессор Micro Four и микрошприц NanoFill объемом 10 мкл для инъекции глюкозы; заполните шприц раствором глюкозы в концентрации 0,5 мг/мкл, растворенной в солевом растворе Кортланда. Важно удалить все пузырьки воздуха из шприца, установить шприц в ультрамикронасос и запрограммировать объем инъекции для первой рыбы, введя значение в нанолитрах с помощью цифровой клавиатуры микропроцессора Micro Four. В завершение подготовьте ледяную анестезию, измельчив достаточное количество кубиков льда, приготовленных из воды, используемой в рыбном хозяйстве.
Чтобы наполнить ведерко со льдом, поместите хирургический стол в более крупную емкость, например, в резиновый контейнер для хранения пищевых продуктов объемом 2,4 литра. Налейте немного теплой водопроводной воды в внешний контейнер и в хирургический стол. Держите рядом резервный бак с теплой водопроводной водой.
Прикрепите термометр к внешнему контейнеру. Поместите внешний контейнер с анестетиком вместе с операционным столом рядом с микроскопом. Подготовьте ведро с колотым льдом поблизости.
Постепенно добавляйте колотый лед, пока температура воды не достигнет 17 °C. На данном этапе не допускайте понижения температуры ниже 17 °C. С помощью сачка перенесите рыб во внешний контейнер.
При температуре 17 °C или чуть ниже рыба обычно расправляет грудные плавники горизонтально, заглатывает воздух, и у нее наблюдаются быстрые движения жаберными крышками. Медленно добавляйте колотый лед в контейнер, чтобы в течение нескольких минут снизить температуру до 12 °C. По мере понижения температуры рыба будет плавать медленнее и в конечном итоге перестанет двигаться.
Со временем жаберное дыхание прекратится, а движения плавников замедлятся. Рыба готова к инъекции, когда перестает реагировать на манипуляции. По достижении требуемой температуры нажмите на губку, чтобы она пропиталась.
Держите пальцы в холодной воде достаточно долго, чтобы они не нагрели рыбу и не вывели ее из состояния анестезии. Аккуратно перенесите рыбу в лоток с губкой, используя охлажденные пальцы. Поместите рыбу брюшком вверх, а жабры — в лоток.
Быстро переместите хирургический стол на предметный столик микроскопа. Действуя оперативно, аккуратно расположите иглу так, чтобы ее кончик был направлен краниально и находился ближе к тазовому поясу, чем к анальному отверстию. Введите иглу по срединной линии между тазовыми плавниками.
Вы должны почувствовать, когда игла пройдет через брюшную стенку. При введении иглы вы ощутите момент прокола стенки. Как только игла окажется в брюшной полости, введите соответствующий объем вещества с помощью микропроцессорного дозатора.
Используйте ножную педаль для введения 1 µL на грамм массы тела рыбы; после инъекции извлеките иглу и немедленно перенесите рыбу обратно в резервуар с теплой водой для восстановления. Осторожно выпустите рыбу из губки в воду резервуара, после чего осмотрите иглу под микроскопом. Иногда к игле может прикрепиться чешуйка, которую необходимо удалить перед следующей инъекцией.
По прошествии подходящего периода времени приступайте к последующему анализу. Мы установили, что для снижения уровня глюкозы в крови до базового уровня перед инъекцией требуется 72-часовое голодание. На данном рисунке данные контрольной группы без инъекций, показанные зеленым цветом, демонстрируют значения глюкозы в крови, которые существенно не отличаются от значений контрольной группы с инъекцией плацебо, показанных здесь красным цветом.
Тем не менее, синяя линия отображает значения глюкозы в крови рыб, которым была введена глюкоза, и показывает подъем и спад уровня циркулирующей глюкозы. В течение всего времени животные, которым вводили как глюкозу, так и плацебо, находились под хирургическим наркозом во время процедуры инъекции, в то время как контрольные животные, не получавшие инъекций, не подвергались хирургическому наркозу. Мы только что продемонстрировали вам, как выполнять внутрибрюшинную инъекцию взрослым данио-рерио.
В нашей лаборатории мы изучаем изменения концентрации глюкозы в крови в различные моменты времени после внутрибрюшинного (IP) введения раствора глюкозы. Однако описанный нами метод может быть использован для инъекции любого интересующего вас раствора. При выполнении данной процедуры помните о необходимости медленного проведения анестезии и осторожного обращения с рыбой.
На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Обзор
В данной статье представлена процедура внутрибрюшинного введения препаратов взрослым зебраниновым рыбкам с использованием микрошприца NanoFil и анестезии холодной водой. Метод предназначен для изучения гомеостаза глюкозы в крови посредством точных инъекций.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология
- Физиология
Теоретическое обоснование
- Интраперитонеальные инъекции необходимы для доставки веществ непосредственно в брюшную полость.
- Zebrafish являются ценным модельным организмом для изучения метаболических процессов.
- Понимание регуляции уровня глюкозы в крови имеет решающее значение для изучения метаболических нарушений.
- Использование анестезии необходимо для минимизации стресса во время процедуры.
Цель исследования
- Продемонстрировать надежный метод внутрибрюшинного введения препаратов у zebrafish.
- Способствовать исследованиям гомеостаза глюкозы и механизмов его регуляции.
- Предоставить протокол, который может быть воспроизведен в других лабораториях.
Используемые методы
- Подготовка рыб путем голодания и взвешивания для определения объема инъекции.
- Анестезия рыб холодной водой для обеспечения минимального движения во время инъекции.
- Введение раствора глюкозы в брюшную полость с использованием прецизионного микрошприца.
- Наблюдение за восстановлением рыб после инъекции для оценки воздействия процедуры.
Основные результаты
- Данная процедура позволяет успешно вводить вещества взрослым особим zebrafish.
- После инъекции можно измерить уровень глюкозы в крови для изучения метаболических изменений.
- Рыбы хорошо восстанавливаются после процедуры, что свидетельствует об эффективности используемой анестезии.
- Результаты способствуют лучшему пониманию гомеостаза глюкозы у zebrafish.
Выводы
- Данный метод представляет собой ценный инструмент для исследователей, изучающих метаболические процессы у zebrafish.
- Интраперитонеальная инъекция является доступным и эффективным способом введения растворов.
- Будущие исследования могут основываться на данном протоколе для изучения различных метаболических состояний.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Точное введение соединений у zebrafish позволяет снизить механистические риски при изучении метаболических мишеней путем установления дозозависимых relationships в системе позвоночных. Этот подход способствует валидации мишеней за счет контролируемого воздействия на гомеостаз глюкозы, что уменьшает неопределенность при исследовании путей. Данный метод повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска, обеспечивая количественные, воспроизводимые фенотипические показатели, актуальные для моделирования метаболических заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем введения определенных доз для оценки взаимодействия с мишенями в путях регуляции глюкозы.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимое введение соединений для минимизации вариабельности при оценке метаболического фенотипа.
- Научная ценность: способствует снижению биологических рисков путем прямого измерения изменений уровня глюкозы в крови как функционального показателя модуляции метаболической мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные измерения зависимой переменной (уровни глюкозы в крови), что обеспечивает проведение анализа «доза — ответ» для идентификации ведущих соединений.
- Практическая ценность: стандартизирует объем инъекции в зависимости от веса рыбы, что повышает воспроизводимость анализа в разных экспериментальных сериях.
- Научная ценность: облегчает подготовку валидированных биологических систем для последующих этапов скрининга метаболизма.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Соответствует системам, связанным с заболеванием, за счет моделирования нарушения гомеостаза глюкозы, характерного для патофизиологии диабета.
- Практическая ценность: Обеспечивает согласованность процедур благодаря стандартизированным протоколам голодания, анестезии и инъекций, что способствует воспроизводимости результатов в разных лабораториях.
- Научная ценность: Позволяет снизить риски при изучении механизмов, отделяя эффект вводимых соединений от стресс-индуцированного повышения уровня глюкозы с помощью контрольных групп, получающих растворитель.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс разработки лекарственных средств — от валидации мишени до оптимизации ведущих соединений, обеспечивая надежный способ введения соединений при проведении метаболических анализов на zebrafish.
- Биология открытий: Помогает в проверке гипотез и уточнении путей регуляции глюкозы, обеспечивая точное введение соединений взрослым зебрафиш.
- Скрининг: Обеспечивает готовность к проведению анализа за счет стандартизированных объемов инъекций, рассчитанных по весу, что гарантирует стабильную экспозицию соединений.
- Аналитика: Позволяет получать количественные показатели глюкозы в крови для сравнения метаболических ответов в различных группах лечения.
- Трансляционные исследования: Обеспечивают преемственность доклинических исследований благодаря использованию модели позвоночного с консервативными механизмами гомеостаза глюкозы.
- Корпоративное повторное использование: Создает возможность многократного применения метода для скрининга метаболических фенотипов различных серий соединений и классов мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности при анализе метаболических путей.
- Практическая ценность: повышает воспроизводимость и стандартизацию за счет четко определенных объемов инъекций и контролируемых процедур анестезии.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») путем предоставления четких данных «доза-эффект» при модуляции гомеостаза глюкозы.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию соединений с учетом рисков на основе валидированных метаболических эффектов в системе целого организма.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с данио-рерио, проведения анестезии и техники инъекций с использованием микрошприцев.
- Зависит от наличия ультрамикронасосов, шприцев NanoFil и установок для анестезии с контролем температуры.
- Необходима межкомандная стандартизация продолжительности голодания, измерения веса и расчета объема инъекции.
- Требуется адаптация в зависимости от растворимости различных соединений и объемов инъекций в растворе соли Кортланда в качестве растворителя.
- Ограничено уровнем технического мастерства, необходимым для поддержания аэрации жабр и предотвращения травматизации места инъекции в ходе выполнения процедуры.
