Обнаружение Neu1 сиалидазы активность в регулировании Toll-подобных рецепторов активации

Общая цель следующего эксперимента заключается в оценке индукции клеточной активности new one sase в ответ на связывание лиганда с его специфическим рецептором. Для этого сначала клетки культивируют в течение 24 часов на круглых стеклянных предметных стеклах диаметром 12 мм в 24-луночном планшете для культивирования тканей. На втором этапе живые клетки, прикрепившиеся к стеклу, помещают в прямой контакт с предварительно подготовленной смесью субстрата sase и лиганда рецептора, с добавлением или без добавления специфических ингибиторов, на предметное стекло микроскопа.

Предметное стекло немедленно помещают под флуоресцентный микроскоп для визуализации и цифровой фиксации флуоресцентных изображений. Со временем получаются результаты, демонстрирующие изменения активности new one sase на поверхности клеток в живых клетках, обработанных лигандом, на основании интенсивности синей флуоресценции вокруг клеток при эпифлуоресцентной микроскопии.

Основным преимуществом использования данного метода по сравнению с существующими способами, такими как спектрофотометрический анализ, является меньший расход реагентов. Кроме того, вы можете наблюдать и регистрировать изображения активности sase в живых клетках. Этот метод может быть использован для решения ключевых вопросов в области иммунологии, например, для изучения потенциально новых взаимодействий лиганд-рецептор, а также для анализа влияния специфических ингибиторов ферментов или белков на активацию рецепторов.

Процедуру продемонстрируют доктор Ray Amit и доктор PT Gath, бывшие аспиранты моей лаборатории, которые используют этот анализ в своих исследовательских работах. Перед восстановлением замороженных макрофагов приготовьте культуральную среду, используя стерильно отфильтрованный DMEM (модифицированная среда Игла), дополненную 10% fetal bovine serum и антибиотиком плазмином в концентрации 5 µg/mL. Затем добавьте 4 mL культуральной среды в культуральный флакон площадью 25 cm² на каждый флакон с замороженными клетками; извлеките флакон с замороженными клетками из морозильной камеры при -80 °C и быстро разморозьте его, согревая в руках внутри стерильного бокса биологической безопасности.

Это займет около двух-трех минут. Как только клетки разморозятся, с помощью стерильной пипетки объемом 1 мл быстро перенесите их в культуральный флакон с кондиционированной средой. Поместите флакон с клетками в инкубатор для культур тканей при 37 °C и 5% carbon dioxide, используя инвертированный микроскоп.

Ежедневно проверяйте рост и адгезию клеток до тех пор, пока они не достигнут 75%–90% конфлюэнтности за несколько дней до посева для анализа SASE. В шкафу биологической безопасности подготовьте круглые предметные стекла диаметром 12 мм, на которые будут высеяны клетки.

Поместите предметные стекла в большую стеклянную чашку Петри и стерилизуйте их, погрузив в 100% ethanol на один час. Слейте спирт и оставьте влажные предметные стекла в ламинарном шкафу под воздействием стерильного фильтрованного потока воздуха и УФ-излучения на 24 часа или до их полного высыхания перед посевом. Затем простерилизуйте изогнутый четырехдюймовый зубчатый пинцет из нержавеющей стали путем обжига в пламени.

Затем с помощью пинцета осторожно поместите по одному стерильному круглому предметному стеклу в каждую лунку 24-луночного полистиролового планшета с плоским дном, обработанного для культивирования тканей. С помощью стерильной пипетки объемом 5 мл удалите кондиционированную среду DMEM из флакона с адгезивными макрофагами. Промойте клетки один раз 1x стерильным трис-буферизированным физиологическим раствором (pH 7.4), чтобы удалить остатки среды, содержащей сыворотку.

Затем добавьте 1 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) с кальцием, не содержащего фосфатов, при pH 7.4. Поместите клетки в инкубатор при 37 °C примерно на 10 минут или до тех пор, пока клетки в колбе не начнут открепляться. После того как клетки открепятся, добавьте к суспензии клеток 3 мл кондиционированной среды DMEM.

Затем перенесите по 0,5 мл суспензии, содержащей примерно 0,5 млн клеток, на каждый 12-миллиметровый круглый предметное стекло в 24-луночном планшете; инкубируйте планшет с культурами макрофагов при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение 24 часов для обеспечения адгезии клеток к предметным стеклам. Анализ активности sase будет проведен в трех различных условиях на трех отдельных предметных стеклах. Первое стекло будет служить отрицательным контролем.

Контрольные клетки подвергают воздействию среды для заключения. К ним добавляют субстрат нейраминидазы для ANA и трис-солевой буферный раствор, но не лиганд Toll-подобных рецепторов LPS. На втором предметном стекле клетки подвергают воздействию среды для заключения, ANA, лиганда Toll-подобных рецепторов LPS и трис-солевого буферного раствора.

На третьем предметном стекле клетки подвергаются воздействию среды для фиксации для ANA, LPS Tris, буферного физраствора и ингибитора нейраминидазы Тамифлю. Мы продемонстрируем процедуру только для второго анализа, так как три анализа различаются только составом смесей соединений на предметном стекле. Поместите предметное стекло на лабораторный стол и последовательно добавьте следующие соединения.

Один микролит среды для заключения, затем один микролит формы, два микролитра LPS и, наконец, три микролитра трис-солевого буферного раствора, pH 7.4. Далее удалите среду из одной лунки 24-луночного планшета с клетками. Следующий этап является самым сложным аспектом данной процедуры, так как необходимо извлечь кругное стеклянное покровное стекло из лунки планшета для культивирования тканей с помощью четырехдюймового пинцета, не разбив его.

Осторожно приподнимите круглый предметное стекло к краю лунки, затем аккуратно извлеките его и поместите в смесь растворов стороной с клетками вниз. Сразу же перенесите предметное стекло на эпифлуоресцентный микроскоп, настроенный на УФ-фильтр и оснащенный цифровой камерой для получения флуоресцентных изображений. Сфокусируйте микроскоп в режиме фазового контраста до появления клеток, а затем переключитесь в режим флуоресценции.

Получите изображения клеток в режиме флуоресценции через одну, две и три минуты. Кроме того, сделайте одно изображение клеток в фазовом контрасте. Здесь представлены результаты эксперимента по анализу sase.

Сначала в качестве отрицательного контроля живые клетки, прикрепленные к предметному стеклу, помещали в прямой контакт с каплей смеси среды для заключения и субстрата для определения активности фосфатазы. Субстрат гидролизовался с образованием свободного этиллюминона, который обладает флуоресцентной эмиссией на 450 нм после возбуждения при 365 нм; измерения проводили через две минуты после добавления субстрата.

На данном флуоресцентном изображении активность SASE вокруг клеток отсутствует. Следующее изображение демонстрирует результаты положительного теста анализа SASE, при котором живые клетки, прикрепленные к предметному стеклу, вступали в прямой контакт с каплей смеси из среды для заключения, субстрата TLR4 и лиганда TLR4 LPS. Субстрат был гидролизован ферментом SASE с образованием свободного этиллюмбеона; флуоресцентное изображение, полученное через две минуты после добавления субстрата и LPS, указывает на высокий уровень активности SASE вокруг клеток.

Однако при помещении живых клеток в прямой контакт с точечной смесью среды для закрепления на наноподложке, лиганда TLR4 LPS, а также ингибитора нейраминидазы Тамифлю, активность сиалидазы значительно снижалась или переставала обнаруживаться в зависимости от концентрации ингибитора. Наконец, этот график показывает 50% ингибирующую концентрацию Тамифлю и осельтамивира карбоксилата, определенную путем построения зависимости снижения активности сиалидазы от логарифма концентрации агента; средняя флуоресценция вокруг клеток для каждой группы измерялась с помощью программного обеспечения Image J. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости культивирования клеток на круглых стеклянных покровных стеклах в 24-луночных планшетах для культивирования тканей за 24 часа до начала анализа на активность сиалидазы.

Кроме того, все реагенты, используемые в данном анализе, должны быть подготовлены до начала работы.