Подготовка жалобы матриц для Количественная Сотовая Сокращение

Общая цель данной процедуры заключается в создании податливых матриксов для модуляции и количественного определения клеточного сокращения. Это достигается путем предварительной активации покровного стекла для обеспечения закрепления матрикса. Вторым этапом процедуры является полимеризация полиакриламидного геля на активированном покровном стекле.

Третьим этапом процедуры является высев клеток на гель и обеспечение их адгезии. Заключительным этапом процедуры является визуализация геля для получения данных, которые будут проанализированы с помощью протоколов микроскопии тяговых сил. В конечном итоге с помощью микроскопии тяговых сил можно получить результаты, демонстрирующие приложение клетками тяговых усилий к матриксу.

Здравствуйте, я Ивонн Эонс из лаборатории Маргарет Элл на физическом факультете и в Институте биофизической динамики Чикагского университета. А я Стивен Винтер, также из лаборатории Гарда. Сегодня мы хотим продемонстрировать вам процедуру изготовления податливых матриц для измерения клеточного сокращения.

Мы используем эти процедуры в нашей лаборатории для изучения сократительных актин-миозиновых сетей. Итак, приступим. Перед активацией покровных стекол заранее подготовьте несколько покровных стекол размером 22 × 40 мм № 1,5.

Промойте в 70% ethanol в штативе из нержавеющей стали так, чтобы покровные стекла были расположены на расстоянии друг от друга и не соприкасались. Работая в вытяжном шкафу, приготовьте 2% раствор three or minor profile trimeth в изопропаноле в квадратном стеклянном кювете. Используйте стеклянную пастельную пипетку, чтобы добавить three or minoro profile.

Из-за реакционной способности триметокси-соединений полностью погрузите покровные стекла в этот раствор и инкубируйте в течение 10 минут при перемешивании на магнитной мешалке в вытяжном шкафу. После замачивания промойте покровные стекла, погрузив их в дважды дистиллированную воду. Замените воду четыре раза; после финальной замены стекла готовы к использованию.

Выдержите образцы в растворе в течение 10 минут при перемешивании. Затем высушите покровные стекла в инкубаторе при температуре примерно 37 °C в течение 10 минут. После высыхания дайте им остыть до комнатной температуры.

Погрузите покровные стекла в 1% раствор глутаральдегида в двойном дистиллированном водяном растворе. Используйте чистую квадратную стеклянную кювету на магнитной мешалке; время выдержки составляет 30 минут.

В противном случае раствор впоследствии может стать мутным. Промойте покровные стекла, трижды заменив дважды дистиллированную воду; каждая промывка должна длиться 10 минут при перемешивании. Затем накройте покровные стекла алюминиевой фольгой для защиты от пыли и высушите их при комнатной температуре.

После высыхания храните покровные стекла в сухом месте, защищенном от пыли, в течение периода до двух месяцев. Для приготовления полиакриламидного геля (PAA) сначала приготовьте основные растворы акриламида и бис-акриламида. Смесь акриламида готовят из 40% акриламида и 2% бис-акриламида, согласно описанию в протоколе RI.

Дегазируйте раствор акриламида в вакуумной камере в течение 20 минут. Это снижает содержание кислорода в геле, который препятствует полимеризации. Тем временем приготовьте 10% раствор персульфата аммония или PS-раствор.

Затем протрите предметные стекла для микроскопа размером один на три дюйма салфетками Rain X, чтобы сделать поверхность стекла гидрофобной. Удалите пыль с помощью салфетки Kim wipe, чтобы обеспечить гладкость поверхности геля. Накройте стекло алюминиевой фольгой и отставьте в сторону.

Затем извлеките раствор акриламида из вакуумной камеры и добавьте флуоресцентные микросферы. Для инициирования полимеризации геля добавьте 0,75 µL TM E и 2,5 µL 10%a PS. Кратковременно перемешайте раствор, несколько раз прокачав его пипеткой. После этого нанесите от 10 до 12 µL раствора акриламида на предварительно подготовленный гидрофобный предметное стекло.

Поместите активированное покровное стекло размером 22 на 40 мм поверх капли. Раствор геля должен полностью покрыть покровное стекло. Удалите все пузырьки воздуха, которые могли появиться в растворе.

Оставьте раствор геля для полимеризации при комнатной температуре примерно на 10 минут. После полимеризации гель отслоится от края покровного стекла. С помощью тонкого конца пинцета осторожно снимите покровное стекло с поверхности предметного стекла вместе с прикрепленным к нему гелем.

Погрузите гель в чашку Петри с дважды дистиллированной водой, чтобы поверхность геля оставалась гидратированной для последующего сшивания белков внеклеточного матрикса (ECM) с гелем. Сначала приготовьте рабочие аликвоты SULF san par объемом 40 µL, растворив порошок SULF san par в безводном диметилсульфоксиде (DMSO). Затем удалите дважды дистиллированную воду с поверхности геля, кратковременно используя центрифугу для покровных стекол.

Следите за тем, чтобы гель не пересох непосредственно перед использованием. Разведите аликвоты sulfur sampa в DMSO в дважды дистиллированной воде и нанесите около 200 µL раствора на центр поверхности геля. Затем подвергните поверхность геля воздействию УФ-излучения в УФ-кросслинкерной печи.

После УФ-облучения погрузите покровные стекла в стакан с чистой дважды дистиллированной водой. Удалите остатки раствора с поверхности геля с помощью центрифуги для покровных стекол. Затем поместите парам в чашку Петри и нанесите 50 µL холодного фибронектина на парам.

Переверните покровное стекло и поместите сторону с гелем поверх фибронектина. Оставьте покровные стекла для реакции при комнатной температуре на один-два часа или при температуре 4 °C на ночь. Инкубацию следует проводить в стерильном вентилируемом шкафу для культивирования тканей.

Поместите покровные стекла в чашки для культивирования тканей диаметром шесть сантиметров с PBS для их покрытия. После промывки тщательно промойте покровные стекла, несколько раз заменив PBS в стерильных условиях. Стерилизуйте покровные стекла путем УФ-облучения в течение 30 минут.

После этого инкубируйте покровные стекла в среде для культивирования клеток в течение 30–45 минут перед посевом клеток. Затем закрепите покровное стекло размером 22×30 мм в верхнем держателе для покровных стекол конфокальной imaging-камеры Warner Instruments, используя вакуумную смазку для фиксации стекла. Поместите формирующую камеру резиновую прокладку поверх покровного стекла, обеспечив доступ к входной и выходной полиэтиленовым трубкам.

Это обеспечит расстояние от 150 до 1000 микрон между верхним покровным стеклом и покрытым гелем покровным стеклом размером 22 на 40 миллиметров, в зависимости от размера используемой прокладки. Затем с помощью соединительного комплекта установите шприцы с подогретой культуральной средой в трубку подачи и убедитесь, что среда проходит через трубку и поступает на верхнее покровное стекло. Нанесите вакуумную смазку на основание камеры и установите покрытое гелем покровное стекло размером 22 на 40 миллиметров стороной с клетками вверх.

Нанесите теплую среду на клетки. Установите верхний держатель покровного стекла на основание камеры так, чтобы прокладки камеры отделяли его от покрытого гелем покровного стекла. Убедитесь, что фиксирующие штифты в основании камеры расположены в соответствующих отверстиях верхнего покровного стекла.

Установите прижимную пластину на основание камеры и с помощью специального ключа прикрутите и зафиксируйте ее. Проверьте поток среды через трубки и камеру, чтобы обнаружить возможные утечки внутри камеры, а также чтобы исключить появление зон, свободных от среды, на поверхности клеток.

Установите камеру для конфокальной визуализации на адаптер предметного столика, расположенный в держателе микроскопа, для получения изображений флуоресцентно меченных белков и флуоресцентных микросфер, встроенных в гелевый субстрат, с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа, чтобы зафиксировать исходное положение микросфер в перфузируемом геле. Выполните промывку для отделения клеточных адгезий от геля и сделайте снимок флуоресцентных микросфер в том же поле зрения, где находились клетки. При правильном выполнении протокола поверхность геля будет относительно плоской и гладкой, а флуоресцентные микросферы будут равномерно распределены по всему объему.

Внеклеточный матрикс (ВКМ) также можно визуализировать с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания на фибронектин. Если измерение сокращения геля проводится в области фокальных адгезий, визуализацию геля и клеток следует осуществлять в конфокальной оптической плоскости фокальных адгезий. Здесь фокальные адгезии визуализированы в эксперименте по силе притяжения в клетках остеосаркомы человека или клетках U2 OS, маркированных GFP pxi.

Сокращение геля можно визуализировать по смещению встроенных флуоресцентных микросфер, расположенных под фокальными адгезиями. Сравнение положений смещенных микросфер (зеленым цветом) и несмещенных микросфер (красным цветом) позволяет количественно оценить смещение гелевого субстрата при сокращении; здесь представлен типичный результат для распластанной клетки, которая отсоединяется от поверхности геля с помощью трипсина. Здесь представлен типичный результат сравнения положений смещенных и несмещенных микросфер.

Использование сложных вычислительных алгоритмов позволяет определить напряжения сдвига, связанные со смещением микросфер, и модуль упругости гелей. Эти напряжения визуализированы здесь с помощью тепловой карты и векторов, где более теплые цвета на тепловой карте и более крупные стрелки обозначают более сильные силы. Мы только что продемонстрировали вам способ изготовления податливых матриц для измерения клеточного сокращения при выполнении данной процедуры.

Важно заранее спланировать работу, чтобы этапы, чувствительные к времени, можно было выполнить быстро. На этом всё. Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.