Отслеживание динамики бактериальной инфекции у мыши с помощью биолюминесценции

Начинают с суспензии ослабленного штамма патогенной бактерии.

Аттенуированный штамм демонстрирует сниженную патогенность из-за целевых делеций в генах вирулентности.

Бактерии хромосомно помечены биолюминесцентным опероном, который обеспечивает автономное производство света.

Бактерии экспрессируют биолюминесцентный оперон, продуцируя фермент люциферазу и ферментный комплекс, синтезирующий субстрат люциферазы.

Люцифераза окисляет подложку с образованием видимого света.

Центрифугируйте суспензию и выбросьте надосадочную жидкость.

Промойте клетки буфером, снова центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, чтобы удалить остаточные неклеточные компоненты.

Повторно суспендируйте клетки в буфере для достижения оптимальной бактериальной концентрации и наберите суспензию в шприц.

Введите суспензию внутрибрюшинно мыши, затем перенесите ее в клетку.

Визуализируйте биолюминесцентный сигнал через равные промежутки времени.

Ослабленный штамм остается локализованным, а биолюминесценция постепенно снижается, что свидетельствует о клиренсе инфекции.

Утром в день инъекции разморозьте криовиальные бактериальные клетки при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех-четырех часов. После размораживания держите флаконы на льду и вводите мышам в течение двух часов. Переложите содержимое каждого криовиала в новую двухмиллилитровую пробирку и центрифугируйте ее при 4500-кратном перегрузке в течение 10 минут.

Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре PBS. Повторите центрифугирование и повторно суспендируйте клетки в PBS до конечной концентрации 2,5 умножить на 10 до девяти колониеобразующих единиц на миллилитр. Возьмите три образца из окончательной суспензии каждого штамма для проверки концентрации, генотипа и фенотипа.

Для каждого штамма апикотируют 1,5 миллилитра клеточной суспензии в двухмиллилитровую пробирку и готовят ПБС для контрольных инъекций. Соберите мышей и материалы, необходимые для инъекций, в стерильной хирургической комнате для животных и протрите все поверхности дезинфицирующими салфетками перед началом работы. Наденьте две пары латексных перчаток, чтобы ограничить риск прокола в случае укуса, а также лабораторный халат, защитные очки и маску для лица.

Извлеките мышь из клетки и взвесьте ее, пометив хвост перманентным маркером для отслеживания после инъекции. Откройте новый одномиллилитровый шприц с иглой 27 калибра и наберите 200 микролитров стерильного PBS. Возьмите мышь за уши, используя большой и указательный пальцы, и сожмите, чтобы создать кожную складку на затылке.

Затем закрепите хвост на ладони с помощью мизинца, чтобы держать мышь ровно и неподвижно. Введите иглу под углом 30 градусов в брюшную полость слева или справа от средней линии. Слегка приподнимите иглу, чтобы она не была введена в органы.

Затем медленно введите PBS и извлеките иглу. Типичным является комок в месте инъекции. Поместите иглу в предназначенный для этого контейнер для утилизации острых предметов и переместите мышь в отдельную клетку.

Повторите процедуру со следующей мышью и после того, как все мыши из одной клетки будут введены, переместите их обратно в исходную клетку. После введения контрольной группы введите тестовые группы по той же процедуре. После того, как все инъекции будут завершены, верните мышей в помещение для содержания и очистите рабочую зону дезинфицирующими салфетками.

Установите подачу кислорода на 1,5 литра в минуту и изофлурана на 3,5% и переместите мышь в анестезиологическую камеру, затем в стадию стабилизации температуры, после анестезии. Положите мышь на спину с вытянутыми руками и установите носовой конус для введения 2,5% изофлурана во время визуализации.

Закройте дверцу и сделайте биолюминесцентные снимки и рентгеновские снимки мыши. Когда визуализация будет завершена, верните мышь в клетку и наблюдайте за ней. Он должен прийти в сознание в течение трех-пяти минут.