Оценка проницаемости кишечника у C. elegans после воздействия бактерий

Возьмём C. Червеи elegans , культивируемые на питательными веществами агарных пластинах, содержащих E. coli — контрольное состояние, а Pseudomonas aeruginosa — для патогенного заболевания.

Во время инкубации черви питаются бактериями, которые заселяют просвет кишечника.

В контрольной стадии кишечный эпителий остаётся целым, а токсины, выделяемые патогенами, вызывают повреждение эпителия.

Промыйте червей буфером и перенесите на тарелки с флуоресцентными трассерами и термоинактивируемыми бактериями в качестве пищи.

В контроле поглощённые флуоресцентные индикаторы остаются в кишечнике, а у зараженных патогенами червей проходят через повреждённый эпителий и попадают в полость тела.

Снова помойте червей и положите их на свежие тарелки. Затем перенесите их на многоколодящую анализную пластину с фиксатором для сохранения клеточной структуры.

Удалите фиксатор. Затем добавьте монтажную среду для визуализации.

Наблюдайте с помощью флуоресцентной визуализации.

Повышенная флуоресценция в полости тела P. Глисты, воздействующие воздействию аэрогинозы, указывают на проницаемость кишечника, вызванную патогеном.

Промыйте личинки L4, синхронизированные по возрасту, S-буфером и перенесите примерно 500 червей на пластины NGM, содержащие различные бактерии и химикаты. Затем инкубировать тарелки при 20 градусах Цельсия в течение 48 часов.

Подготовьте тарелки с добавлением FITC-декстране, смешав 2 миллилитра термоинактивированного э. coli с четырьмя миллиграммами FITC-декстран. Добавьте по 100 микролитров смеси на каждую из 20 свежих тарелок NGM агаров и дайте тарелкам высохнуть 1 час на чистом лабораторном столе. После 48 часов обработки промыйте червей с помощью S-буфера, перенесите их на пластины с добавлением FITC-дексона и на пластины NGM без FITC-декстран, а затем инкубируют пластины на ночь.

На следующий день помойте червей с помощью S-буфера и дайте им побыть в свежей тарелке NGM агаре в течение часа. Добавьте 50 микролитров 4% формальдегида в каждую скважину чёрной пластины с плоским дном на 96 лунок и переместите примерно 50 червей в каждую колодцу. Через 1–2 минуты удалите весь формальдегид и добавьте 100 микролитров монтажной среды в каждую яму.