JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 2:44 мин • March 31st, 2026
Начните с вставка Трансвелла, содержащая кокультуру эпителиальных и бокалоподобных клеток.
Эпителиальные клетки образуют плотные соединения, а кубкообразные клетки производят слизь, воспроизводя эпителиальный барьер кишечника in vivo.
Возьмите суспензию орального бактериального сообщества, обработанную имитированной кишечной жидкостью, чтобы имитировать пищеварение тонкого кишечника.
Замените среду в верхней камере на бактериальную суспензию.
Инкубировать с помощью встряхивания для облегчения склеения бактерий и внутренней формации.
Соберите среду из верхней камеры, содержащей неадгезирующие бактерии, для последующих анализов жизнеспособности.
Добавьте раствор, растворяющий слизь, и инкубируйте, чтобы растворить слизь и высвободить прилипшие бактерии.
Соберите раствор для дальнейшего анализа жизнеспособности бактерий и адгезии.
Промой клетки буфером и добавь моющее средство, чтобы их убрать.
Соберите отстранение камеры.
Вихрь суспензии, чтобы лизировать клетки и выпустить внутренне зажатые бактерии.
Центрифугуйте и собирайте наднатный и клеточный мусор отдельно для дальнейшего анализа.
После промывки и корректировки плотности клеток в тонком кишечнике согласно текстовому протоколу удалите апикальную среду из системы трансвелла и добавьте 1,5 миллилитра бактериальной суспензии.
Совместно культивируйте систему в общих условиях клеточной культуры в течение 2 часов. Добавьте 0,5 миллилитра 10-миллимолярного н-ацетилцистеина в HBSS для растворения слизи, вырабатываемой HT29-MTX, и восстановления приклеенных бактерий.
Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия в течение 1 часа под перемешиванием. Извлеките NAC-HBSS в микроцентрифугной трубке и используйте 1 миллилитр DPBS для дважды промывки клеток. Добавьте 0,5 миллилитра 0,5% тритона X-100 поверх монослоев и разрушайте клетки пипетированием.
Затем быстро восстанавлите жидкость в вихрь на 1 минуту. Скорость крайне важна, чтобы не повредить бактериальные клетки моющим средством. Анализируйте образцы согласно текстовому протоколу.