Измерение спонтанной индукции фагов в лизогенных бактериях в динамике

Возьмите ночную культуру лизогенной бактерии, в которой большинство клеток содержат спящую ДНК фага, интегрированную в их геном.

Инокулируйте культуру в свежую среду и инкубируйте.

Некоторые бактерии подвергаются спонтанной индукции, переходя в литический цикл, при котором происходит вырезание и репликация ДНК фага, а также синтез вирусных белков.

Вновь собранные инфекционные фаги высвобождаются путем лизиса клеток.

Собирайте образцы культуры через определенные интервалы времени.

Для подсчета жизнеспособных неиндуцированных лизогенов нанесите серийные разведения каждого образца на чашку с агаром и инкубируйте.

Подсчитайте количество колоний для определения количества колониеобразующих единиц (КОЕ).

Для подсчета инфекционных фагов нанесите те же разведения на чашку с антибиотикосодержащим агаром, предварительно засеянную устойчивыми к антибиотикам клетками-хозяевами индикаторного штамма. Поскольку лизогены чувствительны к антибиотикам, расти только устойчивые хозяева.

Фаги инфицируют и лизируют клетки, образуя прозрачные бляшки.

Подсчитайте количество бляшек для расчета бляшкообразующих единиц (БОЕ). Более низкие значения БОЕ указывают на меньшее количество событий спонтанной индукции.

Постройте график зависимости КОЕ и ПОЕ от времени. В начале экспоненциальной фазы роста бактерий значение ПОЕ относительно КОЕ минимально, что указывает на минимальную спонтанную индукцию фагов.

Для начала подготовьте свежие культуры лизогена и индикаторного штамма-хозяина, инокулировав ночные культуры в 100 миллилитров LB в соотношении 1:100. Инкубируйте при 37 градусах Цельсия при перемешивании со скоростью 180 RPM.

Для мониторинга роста лизогена каждые шестьдесят минут в течение восьми часов с момента инокуляции отбирайте пробу объемом 1 мл. Выполните серийное разведение культуры, добавив 100 µL пробы в 900 µL среды LB. Перемешайте на вортексе на максимальной скорости и продолжайте серию разведений от 10⁻¹ до 10⁻⁹.

Нанесите по 10 мкл необходимого разведения на чашку с агаром LB. Дайте подсохнуть и инкубируйте при 30 °C в течение 18–24 ч. После инкубации подсчитайте количество колоний и вычислите число жизнеспособных бактериальных клеток, используя приведенную формулу.

Затем, для подсчета инфективных фаговых частиц во временной пробе, добавьте 100 мкл клеток индикаторного хозяина, устойчивых к рифампицину и находящихся в логарифмической фазе роста, в расплавленный верхний агар вместе с рифампицином. Нанесите по 10 мкл серийно разведенной культуры лизогена на инокулированный слой верхнего агара. Дайте препарату высохнуть и инкубируйте при 37 °C в течение 18–24 часов.

После инкубации подсчитайте количество бляшек и рассчитайте число инфекционных частиц фага, используя приведенную формулу.