Компьютерный Крупномасштабные визуализации и количественной оценки островков поджелудочной железы Масса, распределении размеров и архитектуры

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы собрать объективные репрезентативные данные в ограниченной выборке и точно проанализировать сложную трехмерную структуру ткани. Это достигается путем предварительного захвата виртуальных срезов иммуногисто, химически окрашенных срезов поджелудочной железы. Затем виртуальные срезы количественно оцениваются с помощью макроса виртуального среза IHC в программном обеспечении image J, а данные анализируются с помощью скриптов, написанных для системы Mathematica.

Затем выполняется 3D-реконструкция виртуальных срезов с использованием Image J. Заключительным этапом процедуры является захват стопки отдельных изображений островков с помощью программного обеспечения для слайдбука и ручное картографирование стопок изображений в трех измерениях с помощью stereo investigator. Максимально точная архитектура люверса с 3D-координатами для каждой ячейки петли может быть получена с помощью комбинированного метода 3D-визуализации и ручного картографирования. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований ожирения и диабета, такие как влияние физиологии и траектории физиологических состояний на поджелудочную железу, массу бета-клеток, распределение глазниц и архитектуру.

Применение этого метода распространяется на диагностику или терапию ожирения и мелита сахарного диабета, поскольку лучшее понимание изменений в массе бета-клеток будет способствовать разработке и оценке терапевтических вмешательств. Несмотря на то, что методы, описанные в настоящем исследовании, дают представление о динамическом иммуногистохимическом анализе поджелудочной железы, он также может быть применен к целому ряду других организмов и тканей. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы компьютерного анализа сложны для изучения.

Из-за сложности анализа таких больших наборов данных в двух и трех измерениях. Начните эту процедуру с помещения чистого предметного стекла, содержащего целый участок иммуногисто, химически окрашенной поджелудочной железы, в держатель флуоресцентного микроскопа. Откройте программное обеспечение stereo investigator и визуализируйте образец, нажав на кнопку «Захват».

А затем живое изображение. Определите уровни экспозиции для каждого канала с помощью окна видеогистограммы, в котором отображается интенсивность флуоресценции. В этом примере второй канал используется для третьего канала DAP P для четвертого канала GFP для RFP, пятого канала для sci пять и шестого канала для седьмого SCI.

В окне настроек камеры отрегулируйте уровень экспозиции так, чтобы интенсивность флуоресценции снижалась. В правом конце видеогистограммы изображение может быть сфокусировано с помощью фокусного колеса микроскопа. Перед созданием виртуального среза обведите образец по контуру, щелкнув по экрану в точке, удаленной от образца, что отметит точку отсчета.

Затем щелкните по контуру образца, когда контур будет завершен. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Замкнуть контур», чтобы соединить начальную и конечную точки после замыкания контура, захватите виртуальный срез для образца, выбрав «Получение», а затем получите виртуальный срез. Когда откроются опции окна виртуального среза, выберите высокую скорость получения, а также отключите ручную работу.

Фокусировка, сняв галочку напротив пункта «Ручной». Сохраните файл. Откалибруйте префо, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав «Добавить в список сайтов».

Ручная фокусировка нескольких случайных разделов в предварительном просмотре виртуального фрагмента Когда фокус выполнен на нескольких сайтах, запустите виртуальный фрагмент, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав его. Запустите виртуальный слайс с prefo после того, как виртуальный срез будет завершен для первого образца, переключитесь на следующий канал и соответствующим образом настройте экспозицию. Эта процедура повторяется для каждого канала для выполнения количественной оценки глазков, обработки изображений с использованием макроса изображения J с именем I-H-C-V-S, который сначала подготавливает загруженные изображения для анализа, а затем количественно оценивает особенности глазков, такие как клеточный состав.

Макросы I-H-C-V-S разбивают стек на соответствующие цветовые каналы. На изображении J преобразует каждое изображение в восьмибитную черно-белую маску. После автоматической интенсивности, порогового значения и сложения отдельных канальных изображений арифметически в составную маску.

Встроенный в Image J анализ частиц на составном изображении затем определит интересующие области или ROI, исключив частицы размером меньше одной бета-клетки. Количественная оценка ROI. Используя изображение J, создается таблица параметров ячеек.

Сохраните агрегированные результаты в таблице Excel. Хранение таких данных, как круговость по периметру площади, диаметр феры и центр петли для каждого отверстия, а также соответствующие номера, помеченные на изображении. Вычислительный анализ этих параметров может быть выполнен так, как описано в письменном протоколе Чтобы получить информацию, включая распределение глазков и частотный анализ, выполните 3D-реконструкцию виртуальных срезов путем запуска скрипта, который преобразует все изображения JP two в каталоге в файлы TIF, что является форматом, используемым при построении и количественной оценке трехмерных стеков из виртуальных срезов.

Здесь используется скрипт под названием I MJ two two tiff. Скопируйте скрипт в директорию, содержащую два изображения JP. Запустите скрипт с оболочкой Linux, набрав в консоль dot slash I am JP two two TIFF и затем нажав Enter.

Когда все захваченные изображения будут преобразованы из файлов JP 2 в файлы TIFF, они готовы к использованию для анализа на изображении J. Используя изображение J, откройте все изображения для первого образца, которые в данном случае взяты из поджелудочной железы человеческого плода, и объедините их в одно, выбрав изображение, цвет, А затем объединить каналы. Повторите этот процесс для каждого из образцов, когда все образцы будут объединены в одно изображение. Очистите изображения, выделив ненужные области с помощью инструмента выделения полигонов.

Заполните их, выбрав «Редактировать», а затем заполните. Преобразуйте каждое изображение в цветное изображение RGB. Наконец, создайте стек из изображений, после чего их можно дополнительно выровнять с помощью плагина stack reg.

В конечном счете, объединение каналов и объединение изображений создает 3D-монтаж всех люверсов во всей поджелудочной железе. Чтобы собрать стеки изображений, поместите под микроскоп все панкреатические люверсы. Наносите воду, если используете линзу с водяным объективом.

Откройте программное обеспечение для слайдбукинга, получите доступ к элементам управления съемкой и фокусировкой, нажав Ctrl плюс Shift плюс E в окне управления фокусировкой. Установите объектив на 20 или 40 раз в зависимости от размера проушины. Чтобы использовать окуляр микроскопа, установите ячейку для установки люверсов на два раза и установите набор фильтров на один пользовательский.

В окне управления фокусом выбор излучения должен быть установлен на 100%Глаза в нейтральной плотности должны быть установлены на один клик GFP ey, а затем открыть пол для визуализации образца в слайдбуке, вернуться в окно управления фокусом и переключить фильтр в положение фиксации. Затем нажмите G-F-P-D-S. С помощью джойстика отцентрируйте ушко в камере на одно окно как можно лучше.

Сфокусируйтесь на глубине где-то в центре проушины, где клетки можно легко различить. В окне управления фокусом выбираем заб. Используйте элемент управления областью для прокрутки до самой верхней глубины проушины, в которой можно четко различить особенности, и нажмите кнопку «Сверху».

Прокрутите до нижней части ушка и нажмите «Установить». Внизу нажмите кнопку «Перейти». Чтобы вернуться к опорной точке в окне захвата, нажмите на дополнительно, а затем на альтернативный режим канала.

Установите коэффициент ячейки на два раза, а тип захвата на 3D в правой части окна, нажмите использовать верхнее и нижнее положения и вернитесь к центральному объему после захвата. Установите размер шага на три. Установите набор фильтров так, чтобы он находился под полем набора фильтров.

Выберите DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U и SCI пять DSU. Для каждого из них нажмите «Найти лучше» в разделе «Настроить экспозицию». Затем нажмите «Тест», чтобы убедиться, что выбранная экспозиция подходит.

Нажмите «Пуск», чтобы начать захват. Когда захват будет завершен, отрегулируйте уровни по мере необходимости и измените отображаемый цвет для RFP на белый. Сохраните слайд и перейдите к просмотру экспорта серии TIFF.

Введите название слайда с черточкой в конце и сохраните его. Создаются десятки отдельных файлов TIF, поэтому может быть полезно хранить каждую стопку изображений люверсов в отдельной папке. Чтобы сопоставить стеки изображений, откройте программу stereo investigator.

Визуализируйте изображение, открыв стопки изображений в меню масштабирования изображения. Установите расстояние между изображениями в три микрона, чтобы скорректировать двукратный изгиб. В слайдбуке выберите переопределение масштабирования по X и Y и используйте указанный для источника масштаб по X и Y.

Введите 0.65 как для X, так и для Y центра и увеличьте изображение, нажав на кнопку масштабирования, а затем в середине интересующего вас в окне макроса рынка хотя бы на одну ячейку. С помощью соответствующего маркера бета-клетки будут отображаться зеленым цветом. Альфа-клетки будут отображаться красным, а дельта-клетки — белыми.

Отметьте клетки в центре их ядра, которые будут отображаться синим цветом, если образец был окрашен DPI, используйте Маркер два, чтобы отметить бета-клетки. Маркер пять для обозначения альфа-клеток, а маркер шесть для обозначения дельта-клеток. После того, как хотя бы одна ячейка будет отмечена, отобразите ортогональный вид с помощью значка в верхнем меню, отметьте фильтр Z и симметричный.

Диапазон должен быть установлен на 15.00. Начиная с 0.0 Z.Прокрутите проушины с помощью колесика мыши и отметьте каждую ячейку соответствующим маркером, отметьте каждую ячейку только один раз в центре ее глубины. После завершения маркировки каждого из уровней Z флажок фильтра Z можно снять.

Это покажет все маркеры со всех уровней Z. Когда каждая ячейка будет помечена, сохраните файл как файл DAT. Затем перейдите к трассировке экспорта файлов.

Сохраните трассировку в виде файла TXT. Наконец, щелкните новый файл данных, чтобы очистить рабочую область перед попыткой сопоставления новых люверсов. Приготовление виртуальных срезов из иммуногистохимически окрашенного образца поджелудочной железы позволяет исследовать альфа-, бета- и дельта-эндокринные клетки во всей поджелудочной железе вместе, поскольку иммуногистохимическое окрашивание инсулина островков можно увидеть зеленым цветом, глюкагон — красным, соматостатин — белым, а DAP — синим.

Затем изображения преобразовывались в восьмибитную маску после автоматического порогового значения. Здесь показано составное изображение объединения. Тем не менее, распределение люверсов с помощью виртуального среза также позволяет проводить индивидуальный анализ в отдельных каналах.

Здесь показаны виды каждого канала, чтобы выявить дельта-клетки, бета-клетки и альфа-клетки. Анализ частиц с помощью композитной маски, показывающей пронумерованную и выделенную синим цветом структуру каждой глазушки. Анализ частиц композитных масок выводится в виде таблицы данных, содержащей такие параметры, как круговость периметра Islas и различный диаметр для каждого обнаруженного отверстия, идентификаторы которых соответствуют пронумерованным меткам на композитной маске.

Крупномасштабный анализ этих изображений приводит к получению гистограмм общего числа глазок и распределения размеров, а также к детальному сравнению областей альфа-, бета- и дельта-клеток. Картирование глаз и математический анализ клеточного состава и архитектуры могут выявить единую фокальную плоскость из 3D-реконструированной стопки изображений человеческих глаз, загруженных в стереоисследователь. Здесь бета-клетки находятся в зеленом цвете, альфа-клетки — в красном, дельта-клетки — в белом, а ядра — в синем.

После захвата отдельных глазков, альфа-, бета- и дельта-ячеек здесь помечаются в различных морских плоскостях, флуоресцентные изображения и соответствующие данные карт демонстрируются для трех различных фокальных плоскостей с интервалом 10 мкм. После того, как альфа-, бета- и дельта-клетки были помечены в различных плоскостях, глазок может быть визуализирован в 3D. Здесь показана 3D-реконструкция разрезанной на четверть глазка на основе координат, полученных с помощью картографирования глазков.

Кроме того, автоматизированный математический анализ картированных глазков может отображать клеточный состав и архитектуру. Здесь показана относительная частота межклеточных расстояний между двумя клетками в популяции одной клетки. Также показана относительная частота межклеточных расстояний между двумя различными клеточными популяциями.

Также показаны кумулятивные вероятности распределения межклеточных расстояний между клетками для альфа-альфа-клеток, бета-бета и дельта-дельта-клеток. Для получения соответствующих расстояний KS на этих вероятностях может быть выполнен тест Коула О. В. Смирнова или KS. После освоения крупномасштабная визуализация и анализ всего среза ткани могут быть выполнены за четыре часа.

3D-реконструкцию блока ткани можно сделать за 30 минут. Наконец, 3D-визуализация и ручное картографирование могут быть завершены за четыре часа при правильном выполнении. При проведении этой процедуры важно начать с высококачественного иммуногистохимического окрашивания срезов.

Точность последующего анализа будет зависеть только от исходных данных. Кроме того, убедитесь, что ваши компьютеры имеют не менее восьми гигабайт оперативной памяти для обработки такого масштабного анализа после его разработки. Этот метод проложил путь для исследователей не только в области ожирения и диабета, но и во многих других областях, использующих стандартный патологический анализ.

Это может быть особенно полезно, когда доступность образцов ограничена. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как собирать объективные репрезентативные данные в рамках ограниченного размера выборки с помощью стандартных методов. Выбор только определенной области может не отражать всю картину, как мы показали с помощью нашего исследования распределения глазков поджелудочной железы.