Рядом с инфракрасной оптической томографии проекции для Оценки β-клетки массового распространения в исследованиях диабета

Общая цель этой процедуры заключается в проведении оптической проекционной томографии для оценки распределения массы бета-клеток у грызунов, поджелудочной железы или в тканях, содержащих трансплантаты глазков. Таким образом, ближний инфракрасный спектр используется для изучения более крупных образцов и для одновременной визуализации взаимодействующих или соседних типов клеток. Это достигается за счет оборудования, сканера OPT с камерой, чувствительной к ближнему инфракрасному диапазону, мощного источника света и соответствующих наборов фильтров.

Образец сначала изолируют, фиксируют и окрашивают гормональным иммунитетом, прежде чем он внедряется в арос и оптически очищается. Затем он прикрепляется к изготовленному на заказ держателю для образцов. Полуавтоматический инструмент позиционирования используется для обеспечения правильного центрирования сканера после сканирования.

Проекционные изображения подвергаются постобработке для коррекции артефактов, внесенных механической установкой, если это необходимо. Алгоритм эквализации используется для улучшения обнаружения объектов низкой интенсивности. Наконец, сегментация, визуализация и количественная оценка выполняются с помощью программного обеспечения для обработки изображений.

Бета-клетки, продуцирующие инсулин, играют ключевую роль в поддержании гемостаза глюкозы в крови. Таким образом, пространственные и количественные оценки распределения массы бета-клеток поджелудочной железы являются ключевыми для многих областей исследований диабета. В этом видеопротоколе мы описываем адаптацию оптической реакционной томографии или OPT, которая позволяет получать изображения в ближнем инфракрасном диапазоне и, таким образом, возможность получения изображений более крупных тел ткани поджелудочной железы.

Это также позволяет изучать более широкий спектр типов клеток в одном образце. Кроме того, мы представляем подборку разработанных вычислительных инструментов, оптимизированных для визуализации поджелудочной железы в целом, а также для оценки массы В-клеток. В частности, ближний инфракрасный спектр является наиболее благоприятным окном для проникновения света в ткани.

Чтобы получить доступ к этой части спектра в O PT визуализации, был внесен ряд модификаций в оригинальный OPT сканер, описанный коллегами sharpen For single SH оценки массы бета-клеток. При поджелудочной железе мышей мы обычно используем сканирование Omic 3001. Возбуждающий свет подается металлической лампой haa, которая обеспечивает более высокую энергию возбуждения, чем ртутная дуговая лампа, на длинах волн около 650 нанометров.

Свет пропускается через жидкостный световод перед прохождением через фильтры возбуждения. Фильтры, используемые в этом протоколе, показаны в данной таблице для оценки антител к разделению каналов. Конъюгированные с различными напольными красителями Alexa были иммобилизованы на белковых шариках и внедрены в отдельные плоскости агро-фантома.

Изображения демонстрируют, что между различными каналами нет утечки. Излучаемый свет регистрируется с помощью ПЗС-камеры с задней подсветкой и высокой квантовой эффективностью в ближнем инфракрасном спектре. Чтобы облегчить визуализацию больших образцов, поле зрения увеличивается за счет включения в сканер большего отражательного зеркала и вентилятора.

Установка, видимая над ветровой панелью, представляет собой шаговый двигатель, который вращает образец во время сканирования. Лабораторная программа на основе U управляет камерой и шаговым двигателем во время сканирования, собирает поджелудочную железу и ледяную PBS, чтобы избежать деградации протекаторов. Осторожно удалите окружающий жир и мембраны, которые в противном случае могут помешать процедуре окрашивания и сканирования.

Зафиксируйте образец в 4% PFA при температуре четыре градуса Цельсия на два-три часа. Чтобы избежать стабилизации поджелудочной железы в сложенной форме, распылите ее в чашке Петри во время фиксации перед иммуноокрашиванием всего монта, промойте поджелудочную железу излишками PBS. Процедура окрашивания была описана ранее для оценки распределения массы бета-клеток.

Мы обычно полагаемся на комбинацию почечных свиней, антиинсулина, первичных антител и конъюгированных с Alexa Fluor вторичных антител окрашивания. Отделите три основные доли поджелудочной железы. Это облегчает сравнительную оценку лепестков и позволяет сканировать их с большим увеличением.

Промойте поджелудочную железу в воде и замочите ее в агросе. Чтобы удалить любые пузыри. Заделайте поджелудочную железу при низкой температуре плавления 1,5% и держите на глазах до тех пор, пока она не осядет.

Разрежьте агрос блокировкой, закрывая поджелудочную железу. Обязательно оставьте примерно один сантиметр между образцом и основанием агроса. Распорка необходима для крепления образца в держателе образца.

Обезвоживайте поджелудочную железу в стопроцентном метаноле перед оптическим очищением в растворе для очистки B, также известном как Maurice.Clear. Очистите образец до прозрачности. Так как в основном пластиковый, рекомендуется использовать стеклянную бутылку.

Пару раз смените раствор В, чтобы удалить все следы метанола. Теперь образец готов к сканированию. Во время сканирования образец переносится с помощью магнита, прикрепленного к ступенчатому промотору.

Это позволяет перемещать образец по оси X и заданной, что облегчает выравнивание образца перед сканированием. В большинстве протоколов OPT блок обратного осмоса приклеивается к держателю образца, однако большинство подсказок растворяют колбу, и это может привести к нежелательным движениям образца. Поэтому был спроектирован держатель, который исключает использование вида.

Поместите прозрачный образец в держатель и закрепите образец, аккуратно вставив две иглы, ориентируясь на предварительно просверленные отверстия во фланцах держателя. Поместите образец в сканер и погрузите его в раствор BAB. Здесь показан графический пользовательский интерфейс для программного обеспечения на основе лабораторного просмотра, который используется для управления временем экспозиции камеры, ступенчатым промотором и вводом экспериментальных параметров в файл журнала, таких как увеличение.

Фокусная регулировка и смена комплектов фильтров осуществляется вручную на микроскопе. Остановитесь, выбрав увеличение. Осветите образец с помощью фильтра GFP и отобразите изображение предварительного просмотра с помощью программного обеспечения для лабораторного использования.

Поворачивайте образец, чтобы найти его самую широкую часть, обратите внимание при сравнении ряда поджелудочной железы, используйте одно и то же увеличение для всех образцов. Этот коэффициент устанавливается на основе большей выборки в ряду. Далее смените набор фильтров, который отображает конкретный сигнал и отрегулируйте фокусировку.

Обратите внимание, что время экспозиции должно быть выбрано таким образом, чтобы соотношение сигнал/шум было максимально возможным без насыщения какой-либо части образца. Для оценки массы бета-клеток поджелудочной железы весь образец обычно является областью интереса, и поэтому центр масс образцов должен быть точно расположен на его оси вращения для получения оптимальных результатов. Алгоритм коммара вычисляет центр масс образца и предоставляет эталонное изображение, которое облегчает выравнивание центра масс по оси вращения.

Чтобы вычислить координаты X, начните с получения снимка канала GFP при нуле градусов. Затем переключите фильтр и получите снимок конкретного сигнала в той же позиции. Затем примените алгоритм максимизации математического ожидания к изображению GFP для порога интересующей области, примените расчет центра масс на пороговом изображении, наложите вертикальную линию, проходящую через найденную точку центра масс, на изображение конкретного сигнала.

Эти шаги повторяются для образца, повернутого на 90 градусов, чтобы вычислить координаты Z. Наконец, использованы полученные изображения, очерчивающие точки центра масс в качестве ориентира для перемещения образца таким образом, чтобы центральная линия поля зрения проходила через найденный центр масс точек образца. Когда сканирование завершено, проекциям присваивается значение пост-выравнивания для точной настройки положения изображений вдоль оси вращения перед реконструкцией.

Однако небольшая аберрация угла наклона камеры в сторону оптической оси может стать причиной геометрических искажений при реконструкции. Чтобы избежать таких искажений, после сканирования образца используется дискретное выравнивание на основе свободного преобразования, FDA. Из набора данных извлекаются две проекции для расчета FDA.

Эти проекции представляют собой F — удельный сигнал при нулевом градусе и G — удельный сигнал при 180 градусах. Изображение D транспонируется таким образом, чтобы оно соответствовало ориентации F. Функция DFT используется для регистрации восьми блоков высоты пикселей по всему изображению из двух проекций, а измеритель смещается по оси X для вычисления необходимого угла поворота, повторного использования тех же параметров для коррекции всех каналов, полученных в результате одного и того же сканирования. Более подробную информацию об основах алгоритмов COMMAR и FTA можно найти в статье AL Для облегчения сегментации iLet.

На проекционные изображения применяется ограниченный контрастом адаптивный коготь выравнивания гистограммы. В этом протоколе использовалась встроенная функция мата Adapt Hiss Egg, которая применялась с пределом клипсы по умолчанию 0,01 и литами 256. Оптимальный размер шины, однако, должен быть проверен опытным путем и может варьироваться в зависимости от анализируемого образца

В доп. Компенсированные и нормализованные данные выравнивания теперь могут быть реконструированы в томографические срезы. Чтобы визуализировать и количественно оценить полученный стек виртуальных сечений, сгенерируйте 3D-поверхности ISO с помощью подходящего программного обеспечения для обработки изображений, такого как S или скорость.

На этом рисунке показано одно проекционное изображение доли поджелудочной железы, окрашенной для инсулина коктейлем из конъюгированных флуорохромом вторичных антител, включая Alexa Fluor 4 88, 5 94, 6 80 и семь 50. Отношение сигнала к тоно резко увеличивается по мере того, как мы движемся к ближней инфракрасной части спектра. Это дополнительно проиллюстрировано на этом графике, показывающем среднее отношение сигнал/шум для каждого сигнального канала за счет получения доступа к более широкой части спектра.

Визуализация вблизи ОПТ увеличивает диапазон типов клеток, которые могут быть проанализированы в одном образце. В этом видео показана поджелудочная железа из модели диабета первого типа, не страдающего ожирением. На видео инсулин-продуцирующие острова Лангерганса — это синие гладкомышечные альфа-актины, экспрессирующие кровеносные сосуды красного цвета, а CD 3 меченые инфильтрирующие Т-лимфоциты.

Зеленая паренхима теакрина в сером цвете реконструируется на основе эндогенной аутофлуоресценции тканей с использованием увеличенной проникающей пенетрантности жизни в ткани в ближнем инфракрасном диапазоне. Визуализация O PT позволяет оценить распределение массы бета-клеток в гораздо более крупных образцах, чем это было возможно ранее. На этом рисунке показана реконструкция ISO поверхности распределения глазков в доле селезенки толстой крысы SER, меченной инсулином, с использованием ER erdi six 80 в качестве вторичного антитела.

Для точного ориентира показан глобус в виде селезенки мыши. Эти изображения соответствуют двум различным реконструкциям изоповерхности распределения массы бета-клеток в отдельном глобусе поджелудочной железы при появлении кислоты без обработки когтей зеленым цветом, а при применении алгоритма — красным цветом. Наложение двух реконструкций показало, что кулачок облегчает сегментацию также для проушин с низкой интенсивностью сигнала.

Они отображаются красным цветом только на наложенном изображении. Мы только что показали Вам, как извлекается пространственная и количественная информация о массе бета-клеток по всему объему нейрона поджелудочной железы и вплоть до уровня отдельных глазков Лангерганса. Эти протоколы не ограничиваются оценкой бета-клеток или поджелудочной железы при ОПТ, близкой к нарушенной, а также представленными вычислительными инструментами, которые могут быть переведены в другие области исследований.

Удачи. Удачи в ваших экспериментах.