РНК-интерференция в клещи

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать технику РНК-интерференции у клещей путем инъекции. Это достигается путем предварительного синтеза двухцепочечной РНК интересующего гена или генов. Затем РНК вводится клещам, после чего их держат в камере влажности в течение 24 часов.

По истечении этого периода удержания клещам разрешается питаться таким животным, как овца, наконец, клещ. Определяются такие параметры кормления, как вес, линька и положение яйцеклеток, а также экспрессия целевого гена или генов, представляющих интерес, с помощью R-T-P-C-R в реальном времени. В конечном счете, могут быть получены результаты, демонстрирующие влияние сайленсинга целевых генов на биологию клещей путем оценки биологических параметров клещей и экспрессии генов с помощью R-T-P-C-R в реальном времени.

Наша группа работает с клещами, пытаясь охарактеризовать молекулярные события на границе клещевого патогена, чтобы использовать эту базовую информацию для разработки методов контроля заражения клещами и передачи патогенов людям и животным. РНК-интерференция стала важным инструментом в этом исследовании, потому что это единственный доступный метод генетической манипуляции с клещами. Функция многих генов клещей неизвестна.

РНК-интерференция позволяет нам определить роль генов клещей и экспрессии генов во многих аспектах биологии клещей, включая спаривание, размножение, питание, пищеварение, функцию слюнных желез, а также компетентность клещей-векторов в передаче патогенов. Демонстрировать процедуру будет команда по интерференции РНК клещей из нашей лаборатории, доктор Эд Левин, аспирант, а также Басби и я. Для получения двухцепочечной РНК сначала синтезируют олигонуклеотидные праймеры, содержащие Т-семь промоторных последовательностей для транскрипции РНК in vitro.

Например, дерматологический центр вариарен. Используйте олигонуклеотидные праймеры D eight A a T 75 и D eight DVT 73, показанные здесь. Амплифицируйте ген-мишень с помощью R-T-P-C-R с использованием 10 пикомолей каждого олигонуклеотидного праймера и от 1 до 10 нанограммов общей РНК клеща.

Далее очистите продукт ПЦР. Затем используйте восемь микролитров или примерно 100 нанограммов для синтеза двухцепочечной РНК. Чтобы подготовить клещей к инъекции, сначала промойте клещей в следующем ряду растворов: водопроводная вода 3% перекиси водорода, дистиллированная вода дважды, 70% этанол и два заключительных промывки дистиллированной водой.

Выполняйте каждую промывку в одноразовой центрифужной пробирке объемом 50 миллилитров путем встряхивания. Затем сцеживаем раствор через сито из мелкоячеистой проволоки. Высушите клещей на бумажных полотенцах, затем разделите клещей на группы от 20 до 50 в зависимости от эксперимента.

Поместите каждую группу в пластиковый стаканчик объемом 1,25 унции с плотно прилегающей крышкой и пометьте каждый стаканчик экспериментальной группой. Далее соберите команду РНК-интерференции, состоящую из трех человек, которая будет осуществлять процесс инъекции. Первый человек размещает каждого клеща на двойной липкой ленте, прикрепленной к листу красного стоматологического воска размером три на шесть дюймов.

Второй человек вводит клещей, а третий следит за клещами после инъекции, вдыхает углекислый газ на клещей, чтобы активировать их, а также подсчитывает и перекладывает живых клещей в чашки с маркировкой номера экспериментальной группы. Чтобы начать процесс инъекции клеща, захватите клеща с помощью тонких щипцов Dumont и поместите его вентральной стороной вверх на двойную липкую ленту, прикрепленную к листу красного стоматологического воска. Поместите небольшую полоску малярного скотча на ротовые части всех пяти клещей.

Чтобы еще больше их сдержать, оставьте большую часть тела открытой, чтобы процесс инъекции мог наблюдаться с помощью инжектора клеща. Чтобы ввести клеща, проколите отверстие в нижнем правом квадранте вентральной поверхности экзоскелета с помощью шприца с моноэжекционным инсулином, оснащенного иглой диаметром 29 калибра в полдюйма. Затем немедленно введите клещам от 0,2 до 0,5 микролитров раствора двухцепочечной РНК с помощью изготовленного на заказ шприца Hamilton и иглы 33 калибра в один дюйм со скошенным концом под углом 45 градусов, поместите иглу хорошо в полость клеща, чтобы обеспечить размещение и удержание двухцепочечной РНК.

Несмотря на то, что жидкость выделяется после инъекции, глубокое размещение иглы для инъекции гарантирует, что в полость клеща будет отложено достаточное количество двухцепочечной РНК, чтобы вызвать подавление экспрессии генов. Вводите клещам, что вызовет потерю гемолимфы и гибель клеща. Сразу после инъекции клещей соберите их с двойной липкой ленты с помощью тонких щипцов и поместите в пластиковый контейнер для восстановления.

Клещи после инъекции ненадолго останутся неактивными, но вскоре должны начать ползать по посуде. Активируйте клещей, вдыхая на них углекислый газ. Как только клещи начнут ползать и активны, уколочная рана быстро заживет, и они, скорее всего, выживут.

Подсчитайте количество клещей в каждой экспериментальной группе и положите каждую группу в пластиковый стаканчик с этикеткой и плотно прилегающей крышкой. Замените все клещи, которые погибли в текущей группе, перед введением следующей экспериментальной группы. Очистите шприц Гамильтона перед введением следующей экспериментальной группе, наполнив и затем выдавив шприц свежей 3% перекисью водорода.

15 раз с последующим 15 смыванием стерильной водой. Следите за тем, чтобы не согнуть поршень шприца Hamilton, иначе поршень не будет двигаться плавно и реагировать на нежное прикосновение, необходимое для инъекции клеща. После инъекции поместите клещей в камеру с емкостью, наполненной водой и сульфатом калия, которая поддерживает высокую влажность и поддерживает их в течение одних суток.

Затем поместите отдельных клещей в ячейки для кормления клещей, приклеенные к овце, и позвольте им питаться равным количеством неинъекционных самцов или самок клещей, в зависимости от того, какой пол не был инъецирован. Соберите и отмахните от самок клещей после того, как они закончат кормление в течение примерно 10 дней или когда контрольные самки отпадут, хозяин инкубирует каждую группу клещей во влажной камере до завершения положения яйцеклеток. Оцените положение яйцеклеток по группам, взвесив массу яиц, произведенных всеми клещами в группе, чтобы оценить фенотип клещей после кормления.

Определите количество выживших клещей и рассчитайте вес клещей, а также положение яйцеклеток и фертильность яиц. В зависимости от целевого гена и целей исследования могут быть проведены другие анализы для подтверждения сайленсинга гена с помощью R-T-P-C-R. После кормления следует вскрыть слюнные железы и кишечник отдельных клещей из контрольной инъецируемой и двухцепочечной групп РНК, а затем извлечь общую РНК из отдельных образцов тканей.

Анализ транскриптов генов-мишеней в отдельных тканях с помощью R-T-P-C-R в реальном времени и нормализация уровней РНК против рибосомальной РНК клещей 16 s. Используя метод генной нормы, запустить кривые диссоциации в конце реакции, чтобы убедиться, что образуется только один ампликон и что ампликоны последовательно денатурируются в одном и том же температурном диапазоне для каждого образца, сравнить нормализованные значения КТ для уровней мРНК между контрольными инъекционными и двухцепочечными вводами. РНК вводила клещей с помощью Т-критерия Стьюдента.

Описанный здесь протокол был использован в нашей лаборатории для РНК-интерференции у многих различных видов экзотных клещей. Количество двухцепочечной РНК, вводимой в клещей, варьируется в зависимости от размера клеща. Более крупные виды клещей могут вместить больший объем.

Ссылки можно найти в сопроводительной письменной части протокола. Если протокол выполнен правильно, смертность от процедуры инъекции должна составлять менее 5% через 24 часа. Здесь показан типичный фенотип после нокдауна гена у клещей, когда группе клещей вводили пулы двухцепочечной РНК, которые использовались для скрининга защитных антигенов клещей.

У клещей, которые исследуются с помощью световой микроскопии, может наблюдаться клеточная дегенерация в тканях клеща. Фенотипические изменения также могут сопровождаться потерей функции. Например, РНК SUBIN приводит к появлению стерильных самцов, которые не могут успешно спариваться с самками после интерференции РНК и клещей.

Для определения влияния сайленсинга генов на экспрессию генов и белков, а также на биологию клещей можно использовать и другие методы, включая R-T-P-C-R в реальном времени, световую электронную или конфокальную микроскопию. Геномика или протеомика. РНК-интерференция также может быть выполнена в культурах клеточных клеток клещей и обеспечивает метод in vitro для изучения взаимодействий патогенов клещей.