Изготовление микрожидкостных Устройство для дробления Нейрон Сома и Аксоны
22 августа 2007 г.
В этом видео мы продемонстрируем технику мягкой литографии с полидиметилсилоксан (PDMS), который мы используем, чтобы farbricate микрожидкостных устройство для культивирования нейронов.
Добро пожаловать в лабораторию доктора Нью Джона. Лаборатория Джона специализируется на проектировании микрофлюидных платформ для биологических приложений. В этом видео мы продемонстрируем производство и использование микрофлюидного устройства, предназначенного для компартментализации и культивирования первичных нейронов.
Нейронное устройство было впервые опубликовано в журнале Nature Methods в августе 2005 года. С момента своего появления нейронное устройство широко использовалось сотрудниками по всему миру. Нейронное устройство состоит из куска PDMS, который был отлит на кремниевой пластине, содержащей шаблон SUA устройства, который ранее был создан с помощью фотолитографии.
Устройство имеет три основные особенности, четыре резервуара диаметром восемь миллиметров, два основных канала шириной 1,5 миллиметра каждый, длиной семь миллиметров и высотой в сто микрон и микроканавки шириной 10 микрометров и высотой три микрометра, которые соединяют два основных канала. Длина микроканавок может варьироваться от 150 до 900 микрон, хотя стандартная длина составляет 450 микрон. Наблюдая за устройством так, чтобы основные каналы и микроканавки располагались вертикально, мы видим, что резервуары слева от пазов соединены через основные каналы, как и резервуары справа.
Эта особенность позволяет жидкости течь по основному каналу, что является важной особенностью, что дает возможность нагружать ячейки и менять среду. Нейронное устройство имеет три основных преимущества по сравнению с традиционными платформами для культивирования тканей. Во-первых, это позволяет компартментализировать клеточные тела или сомы и аксоны. С помощью нейронного устройства можно получить чистые аксональные фракции.
Размер и длина микроканавок позволяют аксонам проходить через другой основной канал, предотвращая при этом пересечение пильных корпусов. Во-вторых, благодаря конструкции устройства и использованию гидростатического давления, можно подвергнуть отдельные обработки как со стороны ячеек, так и со стороны аксонов устройства, просто поддерживая объем и резервуары выше с одной стороны устройства по сравнению с другой. И в-третьих, чистая аксональная фракция устройства может быть разрезана с помощью вакуумного отсасывания, что позволяет исследователю изучать и наблюдать за регенерацией аксонов.
Исследователь Хина Ли теперь продемонстрирует подготовку устройства микрофлюидных нейронов. Кремниевая пластина размером три анга с рисунком, изготовленным из SU eight методом фотолитографии, используется для литья микрофлюидной формы полидиметилслоуна PDMS. Мы называем силиконовые пластины с рисунком SUA мастер-формами или просто мастерами.
PDMS смешивают с отвердителем в соотношении массы к весу 10 к одному. То есть, например, 15 грамм PDMS на 1,5 грамма отвердителя. Затем PDMS хорошо перемешивается и заливается на кремниевую пластину.
Кремниевая пластина содержится в 10-сантиметровой чашке Петри из полистирола. Требуется примерно от 12 до 15 граммов PDMS, чтобы покрыть MA толщиной примерно четыре миллиметра. Затем мастер с PDMS помещается в вакуумный адгессионный аппарат с крышкой чашки Петри и подается вакуум
.Это делается для того, чтобы помочь удалить пузырьки воздуха из PDMS, которые были введены во время перемешивания отвердителя. Для удаления пузырьков воздуха требуется примерно 15 минут. Мастер с PDMS извлекается из десикации через 15 минут в вакуумной сушке.
На мастере PDMS все еще осталось несколько пузырей. Воздушный пистолет с фильтром 0,45 микрон используется для удаления оставшихся пузырьков. Затем мастер помещается на горячую плиту с температурой 80 градусов на один час для отверждения.
Если вакуумного влагопоглотителя нет, мастер можно оставить при комнатной температуре на несколько часов. Пузырьки воздуха в конечном итоге рассеются сами по себе. Если горячая плита недоступна, PDMS отверждается при комнатной температуре через 24 часа.
Важно следить за тем, чтобы мастер находился на одном уровне в процессе отверждения. После того, как PDMS вылечен на мастере, его помещают в чистый капюшон с помощью хирургического лезвия. По периметру приборов делается вырез круга.
Важно, чтобы при вставке лезвия в PDMS он соприкасался с кремниевой пластиной, но при этом не оказывал слишком большого давления на пластину, иначе мастер треснет с кругом, разрезанным по всему периметру устройств. На каждый трехдюймовый кремниевый мастер приходится четыре устройства. PDMS аккуратно снимается с ведущего.
Это можно начать, осторожно повернув хирургическое лезвие, когда оно вставляется в предыдущий разрез. Он очень тонкий с устройствами PDMS на пресс-форме. Резервуары, расположенные лицевой стороной вверх, вводятся в устройство с помощью восьмимиллиметрового биопсийного перфоратора.
Оставшийся в перфораторе мусор выталкивается стержнем. Затем устройства четвертуются, а излишки PDMS обрезаются, чтобы устройство аккуратно помещалось на крышке Corning. Стекло номер один размером 24 миллиметра на 40 миллиметров азотным воздухом используется для сдувания лишнего мусора.
Въевшийся мусор также можно удалить с помощью виниловой ленты 3M Scotch Brand 4 7 1. Теперь чистые устройства готовы к плазменному соединению. Для кратковременного прикрепления нейронных устройств к покровным стеклам используется очиститель плазмы Herrick
.Устройства и крышки помещаются на лоток, а затем лоток помещается в плазменный очиститель и вакуумный насос, используемый для откачки воздуха из камеры. Важно отметить, что устройства PDMS располагаются лицевой стороной вверх. То есть с конструкцией лицевой стороной вверх, чтобы они подвергались воздействию плазменного газа.
После того, как давление вакуума достигает 300, мощность миллиторра включается на электрическую катушку и устанавливается на высокий уровень. На дверце все щелкается, чтобы впустить немного воздуха в камеру, что поможет генерировать плазму. Аппараты и покровное стекло обрабатываются плазмой в течение двух минут.
Обратите внимание на фиолетовый цвет в камере. Это и есть настоящая плазма. Электрическая катушка создает плазму, которая представляет собой частично ионизированный газ, состоящий из электронов, ионов и нейтральных атос или молекул.
Плазма создает реактивные вещества на поверхности стекла и устройства, которые при совместном размещении образуют прочную связь. Плазма также делает поверхность гидрофильной, что способствует добавлению жидкостей. Плазменный очиститель также стерилизует устройства.
После плазменной обработки в течение двух минут питание в вакууме отключается и воздух подается в камеру. Обработанные плазмой элементы стекла и микрофлюидного устройства собраны в контакте друг с другом на чистом столе. Затем устройства помещаются в стерильную 60-миллиметровую посуду.
Обработанные плазмой поверхности стекла и прибора образуют плотную необратимую связь. В течение 10 минут после плазменного склеивания в аппарат добавляется полиоллизин к стеклу. Через 10 минут гидрофильность прибора снизится.
Затрудняя проникновение ФАПЧ в устройство. Важно проверить наличие пузырьков воздуха в приборе после добавления ФАПЧ. Простой способ удалить присутствующие пузырьки воздуха — использовать пипетку P 200, наполненную 100 микролитрами жидкости.
В этом случае ФАПЧ поместите наконечник непосредственно в отверстие основного канала, затем с силой нажмите на P 200. Возможно, это придется повторить несколько раз, но в конечном итоге усилие от пипетки выгонит пузырьки наружу. Устройства, содержащие ФАПЧ, должны инкубироваться в течение ночи и в стандартном инкубаторе для культуры тканей при температуре 37 градусов с 5% CO2.
После 24 часов инкубации с ФАПЧ устройства дважды быстро промываются автоклавной деионизированной водой. Во время этого процесса жидкость никогда полностью не удаляется из основных каналов, только из резервуаров. Удаление жидкости из основных каналов приведет к появлению пузырьков.
После двух быстрых полосканий устройства снова заполняются автоклавной деионизированной водой и помещаются обратно в инкубатор минимум на три часа или на ночь. На следующий день, после того как устройства были инкубированы с водой в течение ночи или минимум трех часов, их снова переносят в шкаф биобезопасности и дважды промывают деионизированной водой. Затем в устройства добавляется нейронная базальная среда, содержащая необходимые добавки, В 27 и глутамат для культивирования первичных нейронов крысы.
Затем устройства помещаются обратно в инкубатор для дальнейшего использования. Теперь устройства готовы к посадке нейронов. В этом видео мы продемонстрировали технику мягкой литографии, которую мы используем для изготовления наших нейронных устройств.
Эти устройства могут быть использованы для культивирования нейронов и других типов клеток, представляющих интерес. Основным преимуществом этих устройств является возможность отделять и разделять культивирование тел нейронных клеток на одной стороне устройства от чистой аксональной фракции на другой стороне устройства. В следующем видео мы покажем вам, как мы подготавливаем корковые нейроны плода E 18 и как загружаем клетки в устройство.
Вот и все от Лаборатории Джона. Спасибо за просмотр.
Обзор
В данном видео демонстрируется техника мягкой литографии с использованием полидиметилсилоксана (PDMS) для создания микрофлюидного устройства для культивирования нейронов. Устройство позволяет разделять клеточные тела и аксоны нейронов, облегчая проведение передовых исследований в области нейробиологии.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Микрофлюидика
- Техники культивирования клеток
Фон
- Устройство для нейронов было впервые опубликовано в Nature Methods в августе 2005 года.
- Оно широко принято исследователями по всему миру.
- Устройство изготовлено из PDMS, отлитого на кремниевую подложку.
- Оно включает резервуары и каналы, предназначенные для культивирования нейронов.
Цель исследования
- Продемонстрировать изготовление микрофлюидного устройства для культивирования нейронов.
- Показать преимущества использования этого устройства по сравнению с традиционными платформами для культивирования тканей.
- Предоставить подробную методологию для подготовки устройства для нейронов.
Используемые методы
- Смешивание PDMS с затвердевающим агентом в определенном соотношении.
- Использование вакуумного эксикатора для удаления пузырьков воздуха из PDMS.
- Затверждение PDMS на горячей плите или при комнатной температуре.
- Плазменное связывание устройств PDMS с каверс-слайсами для улучшения функциональности.
Основные результаты
- Устройство позволяет разделять клеточные тела и аксоны.
- Оно позволяет проводить различные лечения для различных отделов.
- Исследователи могут получать чистые фракции аксонов для исследования.
- Конструкция облегчает наблюдение за регенерации аксонов.
Выводы
- Микрофлюидное устройство для нейронов является ценным инструментом для исследований в области нейронаук.
- Оно предлагает значительные преимущества для изучения поведения нейронов и их регенерации.
- Процесс изготовления детально описан и может быть воспроизведен исследователями.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Compartmentalized microfluidic platforms enable precise spatial control of neuronal subpopulations, supporting target validation in neurodegenerative disease models. By isolating soma and axon compartments, these systems facilitate mechanistic de-risking of therapeutic candidates through compartment-specific treatment and readout. This approach enhances predictive confidence in early discovery by reducing biological noise and improving assay specificity for axonal regeneration and neuroprotection studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal and somal compartments for independent manipulation.
- Operational Value: Supports functional target validation through compartment-specific treatment and readout of axonal integrity.
- Predictive Value: Increases confidence in lead compounds by reducing confounding signals from cell bodies in axonal assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated neuronal systems for downstream compound screening with compartmentalized readouts.
- Operational Value: Standardizes axonal isolation and culture conditions, improving reproducibility across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates platform reuse for multiple targets and therapeutic modalities in neuroscience discovery.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant neuronal architecture from discovery through preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of target engagement and pathway modulation in axons without somatic interference.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on axonal regeneration or degeneration phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The microfluidic neuron device integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, enabling compartment-specific analysis at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating axonal responses to therapeutic perturbations.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative axonal readouts for reliable compound evaluation in neurodegeneration programs.
- Analytics: Generates compartment-specific measurements (e.g., axonal outgrowth, degeneration) that enable objective comparison of treatment conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical continuity by preserving neuronal polarity and enabling biomarker-aligned axonal assays.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform across multiple projects, reducing redevelopment costs and ensuring consistent neuronal models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in axonal vs. somal responses.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of neuronal compartmentalization assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in neurodegeneration portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on compartment-specific efficacy and safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, PDMS handling, and sterile cell culture techniques.
- Depends on access to plasma cleaners, vacuum desiccators, and precision fabrication tools for master mold preparation.
- Necessitates cross-team standardization of fabrication protocols and quality control for device-to-device consistency.
- Involves adaptation considerations when extending to human iPSC-derived neurons or disease models with altered neurite dynamics.
- Includes practical limitations such as device fouling over long-term culture and the need for media maintenance to prevent channel bubbling.
