iCLIP - транскриптома всей карты белка-РНК взаимодействия с отдельными нуклеотидных Резолюцию

Общей целью данного эксперимента является получение широкой транскриптомной карты сайтов связывания РНК-связывающего белка с индивидуальным нуклеотидным разрешением. Это достигается за счет ультрафиолетового облучения живых клеток для ковалентной сшивки белков и РНК in vivo в качестве второго этапа. РНК-связывающий белок иммуноочищается в строгих условиях с целью восстановления сшитых фрагментов РНК.

Затем обратная транскрипция генерирует CDNA, которые часто усекаются на прикрепленном пептиде, что сохраняет информацию о положении сшивки внутри РНК. Получены результаты, показывающие все сайты связывания в транскриптоме на основе высокопроизводительного секвенирования библиотеки кДНК. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии РНК, такие как то, как взаимодействие различных РНК-белков регулирует процессинг РНК. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы увеличиваем как производительность, так и разрешение наших транскриптомных широких карт взаимодействий белковой РНК

Извлеките средство из 10-сантиметровой пластины клеток целителя. Добавьте шесть миллилитров ледяного PBS и поставьте тарелки на лед. Одной пластины достаточно для трех экспериментов.

Снимите крышку и облучите клетки. При нагреве 254 нанометра и 150 миллиджоулей на квадратный сантиметр соберите клетки, соскребая их с планшетов с помощью клеточного подъемника, перенесите по два миллилитра клеточной суспензии в каждую из трех микропробирок, чтобы гранулировать клетки. Вращайте их на максимальной скорости в течение 10 секунд при температуре четыре градуса Цельсия.

Затем снимите супинатную оснастку, заморозьте ячейки гранул на сухом льду и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до использования. Добавьте 100 микролитров белка, а шарики дина на эксперимент в свежую микропробирку. Если вы работаете с мышиными или козьими антителами, используйте гранулы белка G dyna.

Дважды промойте бусины буфером для лизиса, который можно найти в прилагаемом письменном протоколе. Ресуспендируйте гранулы в 100 микролитрах лизисного буфера с 2-10 микрограммами антител. Вращайте трубку при комнатной температуре в течение 30-60 минут.

Затем трижды промойте бусины 900 микролитрами буфера для лизиса и оставьте их в последней стирке до тех пор, пока не будете готовы продолжить. К иммунопреципитации Тора клеточный дворец на льду. Резус суспензируют в одном миллилитре лизисного буфера и переносят его в микропробирку объемом 1,5 миллилитров

Приготовьте один к 500 разведению РНК один. Затем добавьте в клетку 10 микролитров вместе с двумя микролитрами турбо ДНК. Лизат. Инкубируйте образцы ровно три минуты при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая со скоростью 1, 100 оборотов в минуту, немедленно переложите в лед.

Затем вращайте образцы при температуре четыре градуса Цельсия и 22 000 раз сильнее силы тяжести в течение 20 минут, чтобы очистить лизат, тщательно соберите натант SUP, оставив около 50 микролитров лизата с гранулой для иммуноосадка шариков. Снимите промывочный буфер, затем добавьте подготовленные клеточные лизаты. Вращайте образцы в течение двух часов при температуре четыре градуса Цельсия.

Выбросьте средство SUP и дважды промойте шарики 900 микролитрами буфера с высоким содержанием солей, который можно найти в прилагаемом письменном протоколе. Наконец, дважды промойте бусины с 900 микролитрами буфера для промывки. Затем приступаем к дефосфорилированию и добавляем линкер к РНК трех основных концов.

Для маркировки РНК пять основных концов работают за экраном из плексигласа. Удалите супинат из последней промывки реакции линкерного лигирования и снова суспендируйте шарики в восьми микролитрах горячей смеси PNK. Выдерживать в течение пяти минут при температуре 37 градусов по Цельсию.

Выньте горячую смесь PNK и восстановите. Подвешиваем бусины в 20 микролитрах одноразового буфера загрузки новой страницы. Затем инкубируйте образец на термомиксере при температуре 70 градусов Цельсия в течение 10 минут.

Сразу же поместите образец на магнит, чтобы пустые бусины выпали в осадок. Загрузите образцы на новую страницу от четырех до 12%. Бисс гель в соответствии с инструкцией производителя.

Также загрузите пять микролитров предварительно окрашенного маркера размера белка. Запустите гель в течение 50 минут при напряжении 180 вольт. Перенесите белковые РНК-комплексы из геля на нитроцеллюлозную мембрану с помощью аппарата влажного переноса NOVA в соответствии с инструкциями производителя.

После переноса промойте мембрану в буфере PBS. Затем заверните его в саранскую пленку и выставьте на пленку при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Выполняйте экспозиции в течение 30 минут, одного часа и на ночь.

Затем изолируйте область мембраны в соответствии с комплексами белковых РНК от низких РНК. Экспериментируйте, используя авторентгенограмму в качестве маски. Извлекайте РНК из мембраны с помощью расщепления протеиназы К и экстракции фенолхлороформа.

Проведите обратную транскрибцию РНК с помощью одного из праймеров AYP для очистки CDNA от геля. Смешайте шесть микролитров образца CDNA с шестью микролитрами двухкратного буфера для загрузки мочевины TBE. Непосредственно перед загрузкой образцов в гель.

Нагрейте образцы до 80 градусов Цельсия в течение трех минут. Затем загрузите образцы в сборный гель мочевины 6% TBE вместе с маркером с низкой молекулярной массой. Дайте гелю поработать в течение 40 минут при напряжении 180 вольт, как описано производителем, используя верхний краситель и метки на пластиковой гелевой подложке для направления иссечения.

Разрежьте три полосы со 120 до 200 нуклеотидами, от 85 до 120 нуклеотидов и от 70 до 85 нуклеотидов. Обратите внимание, что дуговой праймер для губ и последовательность L-3 вместе составляют 52 нуклеотида клипсовой последовательности. Добавьте 400 микролитров TE и измельчите гелевый ломтик на мелкие кусочки.

С помощью одномиллилитрового шприца-поршня инкубируйте кусочки геля с встряхиванием со скоростью 1100 оборотов в минуту в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. Поместите два стеклянных предварительных фильтра размером в один сантиметр в колонну CoStar spinx. Перенесите жидкую часть образца в спин колонны в течение одной минуты со скоростью 13 000 оборотов в минуту в пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Добавьте 0,5 микролитра глико синего и 40 микролитров ацетата натрия pH 5,5. Затем перемешайте образец. Добавьте один миллилитр 100% этанола.

Еще раз перемешайте и осадите образец на ночь при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Наконец, сделайте молекулы CD NA круговыми, чтобы прикрепить переходную область к пятому основному концу. Затем повторно линеаризуют и амплифицируют ПЦР в соответствии с прилагаемым письменным протоколом до секвенирования библиотеки глазных клипсов, успех эксперимента можно контролировать в два этапа.

Авторадиограмма комплекса белковой РНК после мембранного переноса и изображение геля продуктов ПЦР на авторентгенограмме образцов с низким содержанием РНК, диффузная радиоактивность должна быть видна выше молекулярной массы белка для образцов с высоким содержанием РНК. Эта радиоактивность фокусируется ближе к молекулярной массе белка. Когда в иммунопреципитации не используются антитела, сигнал не должен быть обнаружен.

Другие важные элементы контроля специфичности иммунопреципитации либо испускают облучение UVE, либо используют клетки, которые не экспрессируют представляющий интерес белок. Изображение геля продуктов ПЦР должно демонстрировать диапазон размеров, соответствующий фракции CD NA. Обратите внимание, что праймеры ПЦР, P три Celexa и P 5 Celexa, вводят дополнительные 76 нуклеотидов к размеру CD NA. Если во время иммунопреципитации антитела не используются, соответствующий продукт ПЦР не должен быть обнаружен

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что каждый из 64 шагов является критическим и должен быть выполнен со стопроцентной точностью. Данные ICL могут быть вычислительно интегрированы с широкими функциональными анализами транскриптома. Это может, например, получить представление о позиционно-зависимой регуляции процессинга РНК.

Что касается вычислительного анализа данных, мы хотели бы обратиться к нашим последним публикациям, опубликованным в сотрудничестве с Европейским институтом биоинформатики Nicholas KA и bla zupan в Университете Лианы. И теперь пришло время начать свои собственные эксперименты. Веселитесь.