iCLIP - транскриптома всей карты белка-РНК взаимодействия с отдельными нуклеотидных Резолюцию

Общая цель следующего эксперимента заключается в получении общегеномной карты сайтов связывания РНК-связывающего белка с разрешением до одного нуклеотида. Это достигается путем УФ-облучения живых клеток для ковалентного сшивания белков и РНК in vivo на втором этапе. РНК-связывающий белок подвергается иммуноочистке в строгих условиях для выделения сшитых фрагментов РНК.

Последующая обратная транскрипция приводит к синтезу кДНК, которые часто обрываются на прикрепленном пептиде, что позволяет сохранить информацию о положении сшивки в РНК. В результате высокопроизводительного секвенирования библиотеки кДНК определяются все сайты связывания во всем транскриптоме. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии РНК, например, о том, как взаимодействие различных РНК-связывающих белков регулирует процессинг РНК. Основным преимуществом этой методики является повышение как эффективности, так и разрешения карт белково-РНК-взаимодействий в масштабе всего транскриптома. Для начала процедуры УФ-сшивки подготовим клетки культур тканей.

Удалите среду из чашки диаметром 10 сантиметров с клетками healer. Добавьте шесть миллилитров ледяного PBS и поместите чашки на лед. Одной чашки достаточно для проведения трех экспериментов.

Снимите крышку и облучите клетки. После воздействия при длине волны 254 нанометра с дозой 150 миллиджоулей на сантиметр квадратный соберите клетки, соскоблив их с планшетов с помощью скребка для клеток; перенесите по два миллилитра клеточной суспензии в каждую из трех микроцентрифужных пробирок для осаждения клеток. Центрифугируйте на максимальной скорости в течение 10 секунд при температуре четырех градусов Цельсия.

Затем снимите супернатант, заморозьте осадки клеток на сухом льду и храните при температуре минус 80 °C до использования. Добавьте 100 µL протеиновых Dynabeads на один эксперимент в новую микропробирку. При использовании антител мыши или козы применяйте Dynabeads с белком G.

Дважды промойте гранулы буфером для лизиса, состав которого указан в прилагаемом письменном протоколе. Ресуспендируйте гранулы в 100 µL буфера для лизиса с добавлением от 2 до 10 µg антитела. Перемешивайте содержимое пробирки на ротаторе при комнатной температуре в течение 30–60 минут.

Затем трижды промойте гранулы 900 µL лизирующего буфера и оставьте их в последней порции промывочного раствора до начала следующего этапа. Для иммунопреципитации поместите осадок клеток Thor на лед. Ресуспендируйте его в 1 mL лизирующего буфера и перенесите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 mL.

Приготовьте разведение RNAs one в пропорции от 1 до 500. Затем добавьте 10 µL данного раствора и 2 µL turbo DNAs к клеточному лизату. Инкубируйте образцы ровно три минуты при 37 °C, перемешивая при 1 100 об/мин, после чего немедленно перенесите на лед.

Затем центрифугируйте образцы при температуре 4 °C с ускорением 22 000 ×g в течение 20 минут для очистки лизата. Осторожно соберите супернатант, оставив около 50 µL лизата с осадком для иммунопреципитации на бусинах. Удалите промывочный буфер, затем добавьте подготовленные клеточные лизаты. Инкубируйте образцы при перемешивании в течение двух часов при температуре 4 °C.

Удалите супернатант и дважды промойте гранулы 900 µL высокосолевого буфера, состав которого указан в прилагаемом письменном протоколе. В завершение дважды промойте гранулы 900 µL промывочного буфера. Затем перейдите к дефосфорилированию и присоединению линкера к 3'-концам РНК.

Для маркировки 5'-концов РНК работайте за защитным экраном из плексигласа. Удалите супернатант после последнего этапа промывки в ходе реакции лигирования линкера и повторно суспендируйте гранулы в 8 µL горячей смеси PNK. Инкубируйте в течение пяти минут при 37 °C.

Удалите разогретую смесь PNK и повторно используйте её. Ресуспендируйте гранулы в 20 µL одного объема буфера для электрофореза в геле. Затем инкубируйте образец в термомиксере при 70 °C в течение 10 минут.

Немедленно поместите образец на магнит, чтобы осадить свободные бусины. Нанесите образцы на новый гель с градиентом от 4 до 12% в соответствии с инструкциями производителя.

Также внесите 5 µL предварительно окрашенного маркера молекулярной массы белков. Проводите электрофорез в геле в течение 50 минут при напряжении 180 В. Перенесите белково-РНК-комплексы из геля на нитроцеллюлозную мембрану с помощью системы для влажного переноса NOVA в соответствии с инструкциями производителя.

После переноса промойте мембрану в буфере PBS. Затем оберните ее пищевой пленкой Saran и подвергните экспозиции на пленке при температуре минус 80 °C. Выполните экспозицию в течение 30 минут, одного часа и в течение ночи.

Затем выделите область мембраны, соответствующую белково-РНК-комплексам, из фракций с низким содержанием РНК. Проведите этот этап, используя авторадиографию в качестве маски. Выделите РНК из мембраны путем обработки протеиназой K и фенол-хлороформной экстракции.

Проведите обратную транскрипцию РНК, используя один из праймеров AYP, для последующей очистки кДНК в геле. Смешайте 6 µL образца кДНК с 6 µL 2-кратного буфера для нанесения с мочевиной в ТБЕ непосредственно перед нанесением образцов на гель.

Нагрейте образцы при 80 °C в течение трех минут. Затем нанесите образцы на готовый 6% TBE-мочевинный гель вместе с маркером низкомолекулярных белков. Проводите электрофорез в течение 40 минут при 180 В согласно инструкции производителя, используя верхний краситель и метки на пластиковой подложке геля для ориентирования при вырезании.

Вырежьте три полосы размером от 120 до 200 нуклеотидов, от 85 до 120 нуклеотидов и от 70 до 85 нуклеотидов. Обратите внимание, что праймер arc lip и последовательность L three в совокупности составляют 52 нуклеотида последовательности clip. Добавьте 400 µL TE и раздробите фрагмент геля на мелкие части.

Используя поршень шприца объемом 1 мл, инкубируйте фрагменты геля при перемешивании со скоростью 1 100 об/мин в течение двух часов при 37 °C. Поместите два стеклянных предварительных фильтра диаметром 1 см в колонку CoStar spinx. Перенесите жидкую часть образца в колонку и центрифугируйте в течение одной минуты при 13 000 об/мин в пробирку объемом 1,5 мл.

Добавьте 0.5 µL glyco blue и 40 µL ацетата натрия с pH 5.5. Затем перемешайте образец. Добавьте 1 mL 100% этанола.

Снова перемешайте и осадите образец в течение ночи при температуре -20 °C. Затем циклизируйте молекулы CD NA, чтобы присоединить адаптерную область к 5'-концу. После этого проведите релинеаризацию и ПЦР-амплификацию согласно прилагаемому письменному протоколу перед секвенированием библиотеки eye clip; успех эксперимента можно контролировать на двух этапах.

На авторадиографии комплекса белок-РНК после переноса на мембрану и на изображении геля с продуктами ПЦР в авторадиографии образцов с низким содержанием РНК должна наблюдаться диффузная радиоактивность выше молекулярной массы белка для образцов с высоким содержанием РНК. Эта радиоактивность сосредоточена ближе к молекулярной массе белка. При отсутствии антител в иммунопреципитации сигнал должен отсутствовать.

Дополнительные важные контроли специфичности иммунопреципитации включают либо УФ-облучение, либо использование клеток, не экспрессирующих исследуемый белок. На снимке геля с продуктами ПЦР должен быть виден диапазон размеров, соответствующий фракции цДНК. Обратите внимание, что ПЦР-праймеры P three Celexa и P five Celexa добавляют дополнительные 76 нуклеотидов к размеру цДНК. Если при иммунопреципитации антитела не используются, соответствующий продукт ПЦР обнаружен быть не должен.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что каждый из 64 этапов является критическим и должен быть выполнен со стопроцентной точностью. Данные ICL могут быть интегрированы с помощью вычислительных методов с функциональными анализами всего транскриптома. Это позволяет, например, получить представление о зависимой от положения регуляции процессинга РНК.

Для проведения компьютерного анализа данных мы рекомендуем обратиться к нашим недавним публикациям, подготовленным в сотрудничестве с Nicholas KA из Европейского института биоинформатики и bla zupan из Университета Liana. А теперь пришло время приступить к вашим собственным экспериментам. Желаем удачи.