Экономически эффективный метод для отслеживания источника микробного Использование Конкретные человека и животных вирусов
3 декабря 2011 г.
Исследование описывает эффективный метод для идентификации источника фекальных / мочи заражения или загрязнения нитратами в воде с помощью КПЦР для конкретного количественного человека / свинины / бычьей ДНК-вирусы, аденовирусы и polyomaviruses, предложил в качестве инструментов MST.
Экономически эффективный метод отслеживания источников микробиологического загрязнения с использованием специфических вирусов человека и животных. В исследовании описывается экономически эффективный метод идентификации источника фекального загрязнения или загрязнения воды нитратами с помощью количественной ПЦР для специфического определения количества ДНК-вирусов человека, свиней и крупного рогатого скота, а именно аденовирусов и полиомавирусов, предлагаемых в качестве инструментов для отслеживания источников микробиологического загрязнения. Нами был разработан протокол концентрирования вирусов из 10 литровых проб воды путем органической флокуляции с использованием экстракции вирусных нуклеиновых кислот из осадка обезжиренным молоком и количественного определения ДНК-вирусов человека, крупного рогатого скота или свиней с помощью количественной ПЦР.
Хорошо известно, что микробное загрязнение витаминов представляет значительный риск для здоровья, в связи с чем необходимо установить источники этого загрязнения. Мы предложили использовать широко распространенные ДНК-содержащие вирусы в качестве инструментов отслеживания источников микробиологического загрязнения. В качестве выбранных вирусов используются аденовирусы и полиомавирусы.
Эти вирусы выделяются постоянно в течение всего года и во всех географических регионах, что было зафиксировано в предыдущих исследованиях. Мы разработали эффективные недорогие методы концентрирования вирусов из воды, а также работали над созданием методов количественной ПЦР для определения содержания аденовирусов свиней и полиомавирусов крупного рогатого скота.
Кроме того, в качестве маркеров загрязнения воды человеческими вирусами мы используем аденовирусы человека и полиомавирусы NGC, определяемые методом количественной ПЦР (кПЦР). Сбор проб воды. В данном исследовании для каждой пробы воды собирают четыре повторности по 10 литров в пластиковые контейнеры с плоским дном, а также одну дополнительную пробу для контроля процесса. В эту последнюю пробу добавляют известное количество вирусных частиц, используемых в качестве контроля.
Отрицательный контроль готовится в лаборатории с использованием водопроводной воды соответствующего качества в одном дополнительном пластиковом контейнере объемом 10 литров. Если образец содержит большое количество взвешенных веществ, песка и других материалов, дайте им осесть в течение 15 минут, затем перелейте воду в новый контейнер. Концентрирование вируса методом органической флокуляции.
Обнаружение вирусов в пробах воды с низкой или умеренной степенью загрязнения требует концентрирования вирусов из нескольких литров воды в значительно меньший объем. Процедура концентрирования включает подкисление проб воды объемом 10 литров, флокуляцию с использованием обезжиренного молока, гравитационное осаждение хлопьев и сбор осадка в 10 миллилитрах фосфатного буфера; для начала процесса готовится раствор обезжиренного молока в искусственной морской воде путем растворения 10 граммов порошка обезжиренного молока в одном литре искусственной морской воды с последующим тщательным доведением pH до 3,5 с помощью соляной кислоты; в результате должны появиться видимые хлопья.
Приготовьте раствор непосредственно перед использованием или храните его при температуре 4 °C в течение 24 часов. Образцы воды перемешивают и измеряют их электропроводность. Если она составляет менее 1,5 мСм, следует добавить морские соли.
Доведите pH пробы воды до 3,5, добавляя соляную кислоту. Зафиксируйте значения pH проб до и после кондиционирования, а также объем использованной соляной кислоты. Также следует зафиксировать значение электропроводности.
После регулировки pH в 10-литровую пробу воды добавляют 100 мл обезжиренного молока (1%), затем образцы перемешивают в течение 8–10 часов, чтобы вирусы адсорбировались на хлопьях. Для пробы с добавлением стандарта, используемой в качестве контроля процесса, в образец добавляют стандартный объем контрольного вируса, например, 1 мл. Перемешивание прекращают и оставляют хлопья оседать под действием силы тяжести на 8–10 часов.
Спустя 16 часов, как правило, на следующий день, можно будет собрать осадок. Для этого удалите супернатант с помощью перистальтического насоса. Соберите осадок вместе с хлопьями (примерно 500 миллилитров) в центрифужную пробирку.
Сбалансируйте пробирки, добавив предварительно охлажденное обезжиренное молоко с pH 3,5, и центрифугируйте их в высокоскоростном центрифугаторе при 8 000 Gs в течение 30 минут при температуре четырех градусов Цельсия. Сразу после остановки центрифуги осторожно извлеките пробирки. Очень аккуратно слейте и удалите супернатант.
Растворите осадок в каждой центрифужной пробирке до конечного объема 10 milliliter фосфатного буфера, экстракции нуклеиновых кислот и количественного определения вирусов. Вирусный концентрат используется для экстракции вирусных нуклеиновых кислот, а количество специфических интересующих аденовирусов и полиомавирусов будет определено с помощью A-Q-P-C-R. Выполните экстракцию нуклеиновых кислот с использованием набора key amp viral RNA mini kit.
Лизис вирусов, содержащихся в 140 µL вирусных концентратов, проводится вручную, после чего осуществляется экстракция суммарных нуклеиновых кислот до объема 80 µL. Данный набор позволяет использовать автоматизированную платформу, такую как Keycube.
Следующим этапом является количественное определение вирусного генома. Копии в образцах определяют с помощью количественной ПЦР с использованием зондов TaqMan; количественное определение человеческих аденовирусов, полиомавирусов JC и полиомавирусов крупного рогатого скота можно проводить на одном 96-луночном планшете. Поскольку для всех этих вирусов используются одни и те же циклы амплификации, аденовирусы свиней следует тестировать отдельно на независимом планшете для количественного определения целевого вируса.
Подготовьте смесь для количественной ПЦР в отдельной чистой зоне. После приготовления смеси внесите по 15 мкл в каждую лунку, включая лунки с контролями. В отдельной зоне добавьте по 10 мкл экстрактов нуклеиновых кислот из образцов; каждый образец в исследуемом виде и в десятикратном разведении в очищенной воде продублируйте. Общий объем одной реакции после добавления мишени составит 25 мкл (15 мкл смеси плюс 10 мкл образца или стандарта). Закройте лунки с образцами частью адгезивной крышки.
Сохраните остальную часть крышки для следующего этапа. Разведение стандартных суспензий ДНК. 10 µL от 10 до 10⁻⁶ копий генома, перенесите в трех повторностях, используя микропипетку, предназначенную исключительно для стандартной ДНК.
Лунки, содержащие стандарты, с предварительно надрезанной адгезивной крышкой. На данном рисунке показано распределение образцов суспензии стандартов и контролей в планшете на 96 лунок.
Проведите QPCR в подходящей системе, выбрав соответствующие параметры после активации amplitude gold в течение 10 минут. При температуре 95 °C выполняют 40 циклов амплификации после завершения реакций. Сохраните данные и результаты согласно руководству пользователя используемого оборудования.
Количество ДНК будет определяться как медиана данных, полученных после корректировки на коэффициент разведения, если это необходимо. График амплификации и стандартная кривая, полученные при количественном определении аденовирусов свиней, показали коэффициент корреляции 0,999. Допустимые значения наклона согласно данной процедуре варьируются от -3,1 до -3,6.
Для определения источников загрязнения в пробах грунтовых вод из района с высоким уровнем содержания нитратов были проведены исследования на наличие известных вирусов человека и животных. В четырех проанализированных повторностях были получены положительные результаты на аденовирусы свиней со средним значением 7,74 × 10² геномных копий на литр, что может быть связано с наличием свиного навоза в районе отбора проб и подтверждает фекальное загрязнение грунтовых вод свиньями. Признаков загрязнения вирусами человека ни в одной из исследованных проб обнаружено не было.
Вирусологические данные были подтверждены методом вложенной ПЦР и секвенированием. Заключение. В данной работе представлены результаты анализа проб грунтовых вод, демонстрирующие загрязнение свинским происхождением при отсутствии загрязнения человеческого или бычьего происхождения. Данная процедура также была применена для анализа купальных вод, морской и речной воды.
Здесь мы представляем процедуру применения этих инструментов для идентификации источника загрязнения грунтовых вод, используя в качестве примера высокие концентрации нитратов, чтобы продемонстрировать применимость разработанных методов для обнаружения источников загрязнения окружающей среды.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен экономически эффективный метод идентификации источников фекального и мочевого загрязнения воды. С помощью количественной ПЦР данный метод позволяет определить количество специфических ДНК-вирусов человека, свиней и крупного рогатого скота, включая аденовирусы и полиомавирусы, используемых в качестве инструментов отслеживания микробных источников.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Отслеживание источников микробиологического загрязнения
- Экологическая микробиология
- Оценка качества воды
Теоретические сведения
- Микробное загрязнение представляет значительный риск для здоровья.
- Выявление источников загрязнения имеет решающее значение для общественного здравоохранения.
- ДНК-содержащие вирусы широко распространены и могут служить эффективными инструментами отслеживания.
- Аденовирусы и полиомавирусы были выбраны в связи с их актуальностью.
Цель исследования
- Разработать метод отслеживания фекального загрязнения воды.
- Количественно определить специфические ДНК-вирусы в пробах воды.
- Углубить понимание источников загрязнения.
Используемые методы
- Концентрирование вирусов из 10-литровых проб воды.
- Органическая флокуляция с использованием обезжиренного молока для экстракции вирусных нуклеиновых кислот.
- Количественное определение ДНК-содержащих вирусов человека, свиней и крупного рогатого скота методом количественной ПЦР.
- Оценка источников загрязнения с помощью выбранных вирусных индикаторов.
Основные результаты
- Успешное концентрирование и количественное определение целевых вирусов.
- Продемонстрированная эффективность метода для отслеживания источников микробного загрязнения.
- Идентификация аденовирусов и полиомавирусов в качестве надежных индикаторов.
- Разработка экономически эффективного решения для оценки загрязнения воды.
Выводы
- Разработанный метод эффективен для выявления источников загрязнения.
- Использование ДНК-вирусов может повысить эффективность отслеживания источников микробиологического загрязнения.
- Данный подход позволяет значительно улучшить мониторинг качества воды.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Идентификация источников загрязнения воды имеет решающее значение для оценки рисков для здоровья населения и экологического мониторинга. Данный метод представляет собой экономически эффективный и высокопроизводительный подход к отслеживанию источников микробиологического загрязнения с использованием видоспецифичных ДНК-вирусов в качестве надежных индикаторов. Он обеспечивает прогностическую достоверность при определении источника загрязнения и позволяет проводить масштабируемый скрининг в различных водных матрицах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять гипотезы о фекальном загрязнении путем количественного определения человеческих аденовирусов, полиомавирусов JC, свиных аденовирусов и бычьих полиомавирусов в качестве специфических биомаркеров.
- Практическая ценность: Предлагает стандартизированный, воспроизводимый протокол концентрирования вирусов из 10-литровых проб воды с использованием флокуляции обезжиренным молоком и гравитационного осаждения.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные данные о числе копий вирусного генома с помощью кПЦР с использованием зондов TaqMan, что обеспечивает высокочувствительное обнаружение свиных и бычьих маркеров в концентрации от 1–10 копий генома на пробирку.
- Практическая ценность: Облегчает высокопроизводительную параллельную обработку множества образцов за счет использования 96-луночных планшетов и автоматизированных платформ для экстракции нуклеиновых кислот.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Способствует моделированию систем, имеющих значение для изучения заболеваний, путем установления связи между вирусными маркерами и источниками загрязнения, такими как свиные навозохранилища в грунтовых водах, что было продемонстрировано на образцах с повышенным содержанием нитратов.
- Практическая ценность: Обеспечивает преемственность этапов от отбора проб из окружающей среды до молекулярного количественного анализа с использованием вложенной ПЦР и секвенирования для подтверждения вирусологических данных.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в рабочие процессы экологической микробиологии — от концентрирования проб и экстракции нуклеиновых кислот до количественного измерения вирусной нагрузки, что позволяет определять источники загрязнения в рамках систем оценки качества воды.
- Открытия в биологии: Обеспечивает проверку гипотез о происхождении загрязнения путем количественного определения специфических вирусных биомаркеров, связанных с фекальным загрязнением человеческого, свиного или бычьего происхождения.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа благодаря одноэтапному протоколу концентрирования, который устраняет недостатки традиционных двухэтапных методов, позволяя одновременно обрабатывать большие наборы образцов.
- Аналитика: Предоставляет количественные результаты с помощью стандартных кривых qPCR и графиков амплификации, при этом допустимые значения наклона составляют от -3.1 до -3.6, а коэффициенты корреляции для количественного определения аденовируса свиней — 0.999.
- Трансляционные исследования: Связывает обнаружение вирусов в окружающей среде с идентификацией источника путем корреляции вирусных маркеров с известными источниками загрязнения, такими как свиной навоз в подземных водах с высоким содержанием нитратов.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую недорогую методику концентрирования и количественного определения вирусов, применимую к купальным водам, морской воде, речной и подземной воде в различных географических регионах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования при отслеживании источников за счет использования стойких, широко распространенных географически ДНК-вирусов, выделяемых с фекалиями и/или мочой.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость благодаря одноэтапному протоколу, включающему подкисление, флокуляцию обезжиренным молоком, гравитационное осаждение и центрифугирование при 8,000 × g в течение 30 минут при 4°C.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о необходимости дальнейших действий при экологическом мониторинге, обеспечивая экономически эффективное высокочувствительное обнаружение источников загрязнения без необходимости в дорогостоящей инфраструктуре.
- Влияние на портфель исследований: Позволяет осуществлять приоритизацию мероприятий по рекультивации с учетом рисков, дифференцируя источники загрязнения в пробах воды на человеческие, свиные и бычьи.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области вирологии окружающей среды, экстракции нуклеиновых кислот, а также разработки и проведения количественного ПЦР-анализа.
- Необходим доступ к центрифугам, способным развивать ускорение 8,000 × g, наборам для экстракции нуклеиновых кислот (например, Key Amp Viral RNA Mini Kit) и системам qPCR с поддержкой зондов TaqMan.
- Требуется стандартизация процесса регулирования pH до 3,5 с использованием соляной кислоты, флокуляции обезжиренным молоком (1% v/v) и времени гравитационного осаждения (8–10 часов) для всех групп и объектов.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных матриц воды, включая предварительное осаждение для проб с высокой мутностью и корректировку электропроводности морскими солями, если она ниже 1.5 mS/cm.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость использования отдельных qPCR-планшетов для свиных аденовирусов из-за возможной несовместимости зондов, даже при использовании схожих циклов амплификации.
