Экономически эффективный метод для отслеживания источника микробного Использование Конкретные человека и животных вирусов
December 3rd, 2011
Исследование описывает эффективный метод для идентификации источника фекальных / мочи заражения или загрязнения нитратами в воде с помощью КПЦР для конкретного количественного человека / свинины / бычьей ДНК-вирусы, аденовирусы и polyomaviruses, предложил в качестве инструментов MST.
Экономически эффективный метод отслеживания источников микроорганизмов с использованием специфических вирусов человека и животных. В исследовании описан экономически эффективный метод идентификации источника загрязнения фекальной мочой или загрязнения нитратами в воде с использованием количественной ПЦР для специфической количественной оценки вирусов свиней и крупного рогатого скота, ДНК вирусов человека, аденовирусов и полиомавирусов, предложенных в качестве инструментов отслеживания источников микробов. Нами разработан протокол концентрирования вирусов из проб воды объемом 10 литров методом органической флокуляции с использованием экстракции вирусных нуклеиновых кислот из отложений из обезжиренного молока и количественного определения DNI вирусов ДНК крупного рогатого скота или свиньи человека с помощью количественной ПЦР.
Хорошо известно, что микробное загрязнение витамина представляет значительный риск для здоровья, и мы должны знать источники этого загрязнения. Мы предложили использовать широко распространенные ДНК-вирусы в качестве инструментов отслеживания источников микробов. Выбраны аденовирусы и полиомавирусы.
Эти вирусы постоянно выделяются в течение всего года и во всех географических районах. Учился в предыдущих учебных заведениях. Мы разработали надежные методы концентрации вирусов в воде с низкой стоимостью, а также работаем над разработкой анализов QPCR для количественного определения пуриновых аденовирусов и полиомавирусов крупного рогатого скота.
Кроме того, мы используем аденовирусы человека, полиомавирусы NGC, протестированные QPCR, также в качестве маркеров загрязнения человека водой, Сбор проб воды. В этом исследовании четыре повтора по 10 литров на пробу воды собираются в пластиковые контейнеры с плоским дном и одна дополнительная проба в качестве контроля процесса. Этот последний образец будет засеменен известным количеством вирусных частиц, используемых в качестве контроля.
Отрицательный контроль готовят в лаборатории с использованием кондиционной водопроводной воды в одной дополнительной пластиковой емкости объемом 10 литров. Если в образце присутствует большое количество взвешенного материала, песка и других материалов, дайте ему отстояться в течение 15 минут, перелейте воду в новую емкость. Концентрация вируса при органической флокуляции.
Обнаружение вирусов в пробах воды с низким или средним уровнем загрязнения требует концентрации вирусов по крайней мере от нескольких литров воды в гораздо меньшем объеме. Процедура концентрирования включает в себя подкисление 10 литров проб воды, флокуляцию с использованием обезжиренного молока под действием силы тяжести, осаждение стад и сбор осадка в 10 миллилитров фосфатного буфера, для запуска процесса готовится раствор для нахождения обезжиренного молока в искусственной морской воде путем растворения 10 граммов сухого обезжиренного молока в одном литре искусственной морской воды и тщательной регулировки рН до 3,5. При использовании соляной кислоты стая должна быть видна.
Приготовьте раствор непосредственно перед использованием или храните при температуре четыре градуса Цельсия в течение 24 часов. Образцы воды перемешивают, и измеряют проводимость в образцах. Если он будет ниже 1,5 миллисименса, то будут добавлены морские соли.
Отрегулируйте pH пробы воды до 3,5 путем добавления соляной кислоты. Запишите pH образцов до и после кондиционирования, а также объем использованной соляной кислоты. Проводимость также должна быть зарегистрирована.
После регулировки pH мы добавляем 100 миллилитров обезжиренного молока pref flod, 1% к 10 литру воды, и перемешиваем образцы в течение восьми-10 часов, чтобы вирусы могли впитаться в стада. Для образца спайка, используемого в качестве контрольного процесса, добавьте к образцу стандартный объем контрольного вируса, например, один миллилитр. Прекратите помешивание и дайте флоку отстояться под действием силы тяжести в течение восьми-10 часов.
Через 16 часов, обычно на следующий день, мы сможем собрать осадочные породы. Для этого удалите надосадочную жидкость с помощью перистальтического насоса. Соберите осадок с помощью флок, примерно по 500 миллилитров в бутылку для центрифуги.
Сбалансируйте горшки, добавив pref flod обезжиренного молока pH 3,5, центрифугируйте горшки с помощью высокоскоростной центрифуги, 8 000 г 30 минут при четырех градусах Цельсия. Как только центрифуга остановится, осторожно извлеките центрифуги из центрифуги. Очень аккуратно слейте и выбросьте надосадочную жидкость.
Растворите гранулу в каждой бутылке центрифуги до конечного объема 10 миллилитров фосфата, экстракция нуклеиновых кислот и количественное определение вирусов. Вирусный концентрат используется для экстракции вирусных нуклеиновых кислот, а конкретные аденовирусы и полиомные вирусы, представляющие интерес, будут количественно определяться с помощью A-Q-P-C-R. Проведите экстракцию нуклеиновых кислот с помощью мини-набора key amp viral RNA.
Лизис вирусов, присутствующих в 140. Микролитры вирусных концентратов выполняются вручную, а общее количество нуклеиновых кислот экстрагируется до 80 микролитров. Этот комплект позволяет использовать автоматизированную платформу, такую как Key cube.
Следующим шагом является количественная оценка вирусного генома. Копии в образцах с помощью количественной ПЦР с сенсорными зондами, аденовирусы человека, вирусы JC Polyoma и вирусы бычьей полиомы могут быть количественно определены в том же 96-луночном планшете. Поскольку все они используют одни и те же циклы амплификации, аденовирусы свиней следует тестировать отдельно в независимой пластине для количественного определения целевого вируса.
Приготовьте количественную смесь для ПЦР в чистом отдельном месте. После того, как смесь будет приготовлена, выделите по 15 микролитров в каждую лунку, включая контрольные. Добавьте экстракцию нуклеиновых кислот из образцов по 10 микролитров в отдельную зону, запустите прямым и десятикратным разведением в очищенной воде каждого образца в двух экземплярах, общий объем за одну реакцию после добавления мишени составит 25 микролитров, 15 из смеси плюс 10 из образца или стандартно накройте лунки, содержащие образцы, частью клеевого покрытия.
Оставьте другую часть чехла для следующего шага. АБ разведение стандартных суспензий ДНК. 10 микролитров от 10 до нуля до 10-шести копий генома, притворяются микролитрами в тройном порядке и с использованием микропбита, используемого исключительно для стандартного покрытия ДНК.
Лунки, содержащие эталоны с предварительно наклеенной крышкой, обрезаются. На этом рисунке показано распределение стандартных образцов суспензии и контрольных образцов. В 96 лунке пластина.
Проведите QPCR в подходящей системе, выбрав соответствующие параметры после активации амплитудного золота в течение 10 минут. При температуре 95 градусов Цельсия после завершения реакции выполняется 40 циклов амплификации. Храните данные и результаты, как описано в руководстве пользователя используемого оборудования.
Количество ДНК будет определено как медиана данных, полученных после коррекции фактора разведения, когда это необходимо. График амплификации и стандартная кривая, полученные для количественного определения аденовирусов свиней, показали коэффициент корреляции 0,999. Допустимые значения уклона находятся в диапазоне от минус 3,1 до минус 3,6 после процедуры.
Описанные вирусы человека и животных были протестированы на образцах грунтовых вод из района с высоким уровнем нитратов для определения источников загрязнения. Четыре проанализированные реплики показали положительные результаты по среднему значению аденовирусов свиней, 7,74 на 10 до двух копий генома на литр, что было бы связано с наличием свиных суспензий в районе вокруг места отбора проб и доказало бы наличие фекального загрязнения свиней в грунтовых водах. Ни в одном из испытуемых образцов не было обнаружено никакого заражения человеком.
Вирусологические данные были подтверждены методом вложенной ПЦР и анализа секвенирования. Заключение. В данном исследовании мы представили результаты анализа проб грунтовых вод, свидетельствующих о загрязнении свиного происхождения при отсутствии загрязнения человеком или быком. Процедура также применяется для анализа вод для купания, морской воды и речной воды.
Мы представляем здесь процедуру применения этих инструментов для идентификации источника загрязнения в подземных водах, представляя высокие уровни нитратов в качестве примера применимости разработанных методов для обнаружения источника загрязнения в окружающей среде.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
В этом исследовании представлен экономически эффективный метод для выявления источников загрязнения воды калом и мочой. Используя количественную ПЦР, метод определяет количество специфических человеческих, свиных и бычьих ДНК-вирусов, включая аденовирусы и полиомавирусы, в качестве инструментов для отслеживания микробных источников.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Отслеживание микробных источников
- Экологическая микробиология
- Оценка качества воды
Фон
- Микробное загрязнение представляет значительный риск для здоровья.
- Определение источников загрязнения важно для общественного здоровья.
- ДНК-вирусы распространены и могут служить эффективными инструментами отслеживания.
- Аденовирусы и полиомавирусы выбраны из-за их значимости.
Цель исследования
- Разработать метод для отслеживания загрязнения калом в воде.
- Количественно определить специфические ДНК-вирусы из образцов воды.
- Улучшить понимание источников загрязнения.
Используемые методы
- Концентрирование вирусов из 10-литровых образцов воды.
- Органическая флокуляция с использованием обезжиренного молока для извлечения вирусных нуклеиновых кислот.
- Количественное определение человеческих, свиных и бычьих ДНК-вирусов с помощью количественной ПЦР.
- Оценка источников загрязнения с помощью выбранных вирусных индикаторов.
Основные результаты
- Успешное концентрирование и количественное определение целевых вирусов.
- Доказанная эффективность метода для отслеживания микробных источников.
- Аденовирусы и полиомавирусы определены как надежные индикаторы.
- Предоставлен экономически эффективный способ оценки загрязнения воды.
Выводы
- Разработанный метод эффективен для выявления источников загрязнения.
- Использование ДНК-вирусов может улучшить усилия по отслеживанию микробных источников.
- Этот подход может значительно улучшить мониторинг качества воды.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Identifying contamination sources in water is critical for public health risk assessment and environmental monitoring. This method provides a cost-effective, high-throughput approach to microbial source tracking using species-specific DNA viruses as reliable indicators. It supports predictive confidence in contamination source attribution and enables scalable screening across diverse water matrices.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fecal contamination hypotheses through quantification of human adenoviruses, JC polyomaviruses, porcine adenoviruses, and bovine polyomaviruses as specific biomarkers.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible protocol for viral concentration from 10-liter water samples using skimmed milk flocculation and gravity sedimentation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative viral genome copy data via qPCR with TaqMan probes, enabling sensitive detection down to 1-10 genome copies per test tube for porcine and bovine markers.
- Operational Value: Facilitates high-throughput processing of multiple samples in parallel using 96-well plate formats and automated nucleic acid extraction platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by linking viral markers to contamination sources such as porcine slurries in groundwater, as demonstrated in nitrate-impacted samples.
- Operational Value: Ensures translational continuity from environmental sampling to molecular quantification, with nested PCR and sequencing used for virological data confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into environmental microbiology workflows from sample concentration through nucleic acid extraction to quantitative viral measurement, enabling source attribution in water quality assessment pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding contamination origins by quantifying virus-specific biomarkers associated with human, porcine, or bovine fecal sources.
- Screening: Delivers assay readiness through a one-step concentration protocol that eliminates bottlenecks of traditional two-step methods, allowing simultaneous processing of large sample sets.
- Analytics: Provides quantitative outputs via qPCR standard curves and amplification plots, with acceptable slope values between -3.1 and -3.6 and correlation coefficients of 0.999 for porcine adenovirus quantification.
- Translational Research: Connects environmental detection to source identification through correlation of viral markers with known contamination sources, such as porcine slurry in high-nitrate groundwater.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, low-cost capability for viral concentration and quantification applicable to bathing waters, seawater, river water, and groundwater across diverse geographical areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in source tracking by using persistent, geographically widespread DNA viruses excreted in feces and/or urine.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through a one-step protocol involving acidification, skimmed milk flocculation, gravity sedimentation, and centrifugation at 8,000 × g for 30 minutes at 4°C.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in environmental monitoring by providing cost-effective, high-sensitivity detection of contamination sources without requiring expensive infrastructure.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of remediation efforts by distinguishing between human, porcine, and bovine contamination sources in water samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in environmental virology, nucleic acid extraction, and quantitative PCR assay design and execution.
- Needs access to centrifugation equipment capable of 8,000 × g, nucleic acid extraction kits (e.g., Key Amp Viral RNA Mini Kit), and qPCR systems with TaqMan probe compatibility.
- Demands standardization of pH adjustment to 3.5 using hydrochloric acid, skimmed milk flocculation (1% v/v), and gravity sedimentation timing (8–10 hours) across teams and sites.
- Involves adaptation considerations for varying water matrices, including pre-sedimentation for high-turbidity samples and conductivity adjustment with sea salts when below 1.5 mS/cm.
- Includes practical limitations such as the need for separate qPCR plates for porcine adenoviruses due to potential probe compatibility issues, even when using similar amplification cycles.
