Выделение вариантов Fidelity РНК-содержащих вирусов и характеристика вирусов Частота мутаций

РНК-содержащие вирусы используют вирусные РНК-полимеразы для репликации своих геномов. Эти полимеразы характеризуются более высокой частотой ошибок, что позволяет вирусу быстро адаптироваться и эволюционировать. В данном видео представлен оптимизированный метод скрининга и идентификации вирусов с мутациями в РНК-полимеразе, которые влияют на частоту ошибок или точность (фиделити) репликации.

Сначала мутагены воздействуют на клетки-хозяева вируса, чтобы определить максимальный уровень мутагена, который можно использовать без гибели клеток или подавления вируса. После определения оптимальных условий вирус пассируют под селективным давлением РНК-мутагенов. Затем проводят секвенирование популяции, устойчивой к мутагену, для идентификации ответственной за это мутации.

Затем выделяют мутаген-резистентный мутант. Проводится мониторинг кинетики репликации, результаты которого демонстрируют увеличение или снижение точности работы полимеразы. Это сопровождается широкой устойчивостью к РНК-мутагенам и изменением частоты мутаций в популяции вируса.

Основным преимуществом данного метода перед существующими подходами, такими как анализ биохимической точности с использованием очищенных полимераз, является то, что описанные техники применимы к любому РНК-содержащему вирусу, который может быть культивирован в культурах тканей. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы вирусологии, например, о роли точности работы полимеразы в адаптации и эволюции вирусов. Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями из-за использования либо слишком сильного, либо слишком слабого селективного давления, а также из-за отсутствия оптимизации размера анализируемого участка последовательности и количества клонов для достижения достаточной статистической мощности.

Начните этот эксперимент с определения диапазона концентраций мутагена, которые могут быть использованы в последующих опытах без летального исхода для клеток. Аспирируйте среду из шестилуночных планшетов, содержащих субконфлюэнтные монослои клеток воротной зоны. Затем добавьте два миллилитра среды с добавлением мутагена; в данном случае используются следующие мутагены: рибавирин, 5-фторурацил, 5-азацитидин, хлорид магния и хлорид марганца.

Инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2. Затем каждые 24 часа в течение следующих двух-семи дней используйте одну лунку с клетками для проверки жизнеспособности методом исключения трипанового синего. С помощью гемоцитометра рассчитайте процент жизнеспособных клеток для каждой концентрации мутагена, включая условия необработанного контроля, чтобы к моменту завершения инфицирования гибель клеток составляла менее 50%.

Когда достигаются идеальные максимальные титры, следующим этапом процедуры является определение концентрации мутагена, которая обеспечит оптимальное селективное давление без избыточного мутагенеза популяции при соответствующих концентрациях. Каждый геном подвергается мутации по крайней мере в одной или двух позициях. Таким образом, мутаген вызовет мутацию резистентности, которая затем будет отобрана в процессе пассажей.

При введении слишком большого количества мутаций мутанты, несущие мутацию устойчивости, сами погибнут. Мутаген препятствует их изоляции в шестилуночных планшетах, засеянных клетками. Для наших клеток при использовании 2 мл среды с добавлением мутагена применяется тот же диапазон концентраций, что и ранее, за исключением концентраций, при которых гибель клеток превысила 50%.

Инкубируйте в течение двух часов для поглощения мутагена. После инкубации аспирируйте среду и проведите заражение вирусом с низкой множественностью инфекции в 200 µL; инкубируйте от 15 до 60 минут для инфицирования клеток, периодически покачивая планшет, чтобы инокулят полностью покрывал клеточный монослой. Аспирируйте инокулят вируса и дважды промойте клетки двумя миллилитрами PBS, чтобы максимально удалить остатки инокулята.

Затем в каждую лунку добавьте среду с мутагеном и инкубируйте клетки в течение времени, эквивалентного трем-шести циклам репликации, обычно от двух до семи дней. Соберите вирус из каждой лунки и проведите стандартной анализ бляшек или метод предельного разведения для определения противовирусного эффекта на титр вируса на основе рассчитанных титров. Определите концентрацию мутагена, которая снижает титры вируса по сравнению с нелеченым контролем инфекции на 0,5–2 порядка (log) и при этом не обладает высокой токсичностью для клеток.

В идеале токсичность должна составлять менее 50% для выделения мутаген-резистентных вариантов; начните с пассирования вируса в клетках-хозяевах с оптимальной концентрацией каждого мутагена. Может потребоваться до 30 пассажей; при каждом пассаже определяйте титр вируса, после чего повторите инфицирование и инкубацию с мутагеном, как показано здесь. Титры вируса в образцах, подвергнутых воздействию мутагена, должны снизиться в течение первых нескольких пассажей по сравнению с исходным титром вируса и титрами вируса в необработанном контроле. Когда титры вируса для данной серии достигнут того же порядка, что и титры в необработанном контроле, это будет свидетельствовать о возникновении резистентности.

Выделите вирусную РНК для секвенирования, используя праймеры, которые амплифицируют гены полимеразы или репликазы исследуемого вируса. Получите кДНК вирусного генома с помощью ОТ-ПЦР, затем проведите секвенирование ДНК. После получения данных о последовательности.

Используйте программу для выравнивания, чтобы сопоставить полученные последовательности с референсным консенсусом и выявить новые точечные мутации. Кроме того, проверьте хроматограммы на наличие минорных пиков, которые могли быть пропущены программой выравнивания. Мутант, представляющий 20–30% от общей популяции, все еще будет виден в виде пика, однако он будет слишком мал, чтобы быть определенным как смешанный нуклеотид при стандартном анализе последовательностей. Чтобы идентифицировать интересующую мутацию, ищите однонуклеотидные полиморфизмы, которые появляются исключительно в популяции, подвергшейся воздействию мутагена, по сравнению с необработанным контролем из того же пассажа, как показано здесь. После идентификации мутации резистентный вариант должен быть регенерирован из инфекционной кДНК или изолирован в культуре тканей, а фенотип резистентности должен быть подтвержден.

Здесь мы используем метод бляшкообразования для выделения идентифицированных мутантов. Подготовьте серию разведений образца, устойчивого к азоту, и нанесите их на монослои клеток в 6-луночных планшетах для проведения анализа бляшек после инкубации в течение одного часа при 37 °C и 5 % carbon dioxide. Через два-пять дней после инфицирования нанесите слой агарозного покрытия.

Пlaque должны быть четко видны. В идеале на одной из чашек должно образоваться от 10 до 50 хорошо разделенных плак. Отметьте расположение плак на чашке точкой с помощью маркера; чтобы не сместить слой агара, осторожно проколите агаровый слой наконечником с фильтром P 200.

Чтобы добраться до бляшки, осторожно поднимите наконечник из слоя агара и перенесите пробку aros в микроцентрифужную пробирку, содержащую 250 µL среды. Достаточное количество вируса будет перенесено независимо от того, будет ли пробка aros извлечена из наконечника или перемешана в пробирке вортексером, чтобы получить до TenX на одну обработку. Сохраните часть образца для последующего амплифицирования живого вируса.

Затем выделите РНК из остатка образца и проведите РТ-ПЦР, чтобы определить образец бляшки, содержащий искомую мутацию. Секвенируйте кДНК. Убедитесь в отсутствии дополнительных мутаций.

Затем приготовьте больший запас этого вируса для всех последующих исследований. Далее, чтобы подтвердить резистентность, обусловленную выявленной мутацией, повторите анализ с использованием нескольких условий мутагенеза.

Если вариант устойчив к нескольким мутагенам, он, вероятно, обладает повышенной точностью репликации. Поскольку мутации, изменяющие точность, локализуются в полимеразе, важно подтвердить, что кинетика репликации не претерпела значительных изменений. Перед определением частоты мутаций исследуйте репликацию по крайней мере двумя взаимодополняющими методами.

Например, в дополнение к методам анализа синтеза РНК, таким как количественная R-T-P-C-R или нозерн-блоттинг, может быть применен подход для оценки продукции вируса, например, метод определения количества бляшек или TCID 50. Далее, чтобы подтвердить, что выявленное изменение полимеразы, обеспечивающее резистентность к мутагену, влияет на репликацию, измеряют частоту точечных мутаций, определяющих точность копирования. Этот анализ можно проводить как на жизнеспособной, так и на общей популяции вируса.

Для определения частоты мутаций в общей популяции вируса, включающей жизнеспособные и нежизнеспособные варианты, выделите РНК и с помощью ОТ-ПЦР амплифицируйте участок длиной от 800 до 1 200 нуклеотидов из кодирующей последовательности, в которой известно наличие генетических вариантов, например, кодирующей структурный белок. Затем проведите TOPO-TA клонирование очищенного продукта для каждой исследуемой популяции вируса. Отберите 96 колоний, идентифицированных как содержащие положительную вставку с помощью сине-белого скрининга на чашках с покрытием xga.

Проведите ПЦР отдельных колоний для подтверждения достоверности сине-белого скрининга. При использовании указанного выше размера фрагмента и условий примерно 90% колоний должны оказаться положительными. Для каждой положительной белой колонии используйте зубочистку, чтобы перенести её в 1 mL среды LB в 96-луночный планшет.

Чашки с бактериальной культурой инкубируют в течение ночи при 37 °C при постоянном перемешивании. На следующий день выделяют ДНК, подготавливая мини-препараты в 96-луночном формате; каждую плашку секвенируют, используя достаточное количество праймеров для получения максимального покрытия клонированного сегмента.

Для этого должно быть достаточно двух праймеров с охватом 600 оснований. Проведите анализ последовательностей, используя референсную или консенсусную последовательность для каждой популяции и подходящее программное обеспечение для выравнивания, которое позволяет легко идентифицировать однонуклеотидные полиморфизмы. Рекомендуется использовать программное обеспечение от DNASTAR Laser.

Сначала используется Gene для удаления последовательностей низкого качества, например, с ошибками определения оснований на концах или слишком коротких последовательностей. Выполните выравнивание оставшихся последовательностей. Определите диапазон нуклеотидов, который охвачен всеми последовательностями в анализе.

Отбракуйте клоны, которые не полностью покрывают данный регион. Для корректного сравнения крайне важно, чтобы один и тот же регион был покрыт полностью. Выявите и подсчитайте однонуклеотидные полиморфизмы, которые отличаются от референсного штамма.

Рассчитайте частоту мутаций, разделив общее количество однонуклеотидных полиморфизмов на общее число секвенированных нуклеотидов. Представьте этот результат как среднее количество мутаций на 10 000 секвенированных нуклеотидов. Если один и тот же однонуклеотидный полиморфизм обнаруживается в большом количестве клонов, приведите два значения: с учетом и без учета этих повторяющихся мутаций.

Определите распределение мутаций. Составьте ранжированный список количества клонов в каждой популяции, имеющих 0, 1, 2, 3 и так далее мутаций. Мутации в регионе, секвенированном в качестве опции.

Используйте отредактированные последовательности для расчета всех возможных попарных сравнений внутри образца, чтобы получить средние значения популяционного разнообразия. Для этого доступно несколько программ выравнивания. Программа анализа молекулярной эволюционной генетики, также называемая MEGA, используется для определения оптимальных условий отбора устойчивости РНК к мутагенам.

Наши клетки обрабатывали возрастающими концентрациями рибавирина и заражали вирусом Cox AKI B дикого типа с множественностью заражения 0,01 через 48 часов после инфицирования. Потомство вируса собирали, а титры определяли методом TCID₅₀. На данном рисунке вдоль оси x указан процент клеток, выживших после обработки, который определяли путем окрашивания трипановым синим через 48 часов после инфицирования.

Результаты показывают, что концентрации 100 и 200 мкМ снижают титр вируса на один-два порядка без влияния на жизнеспособность клеток. Для селекции популяций, устойчивых к мутагену, вирус CHI ganga культивировали в клетках hilar в присутствии (серые полосы) или в отсутствие (черные полосы) 50 мкМ рибовирина; после каждого пассажа количество потомства вируса определяли с помощью классического метода агаровых слоев на клетках BHK, как показано здесь. Мутагенный эффект очевиден в течение первых пассажей, когда титр обработанного вируса снизился на два порядка.

Постепенно титр вернулся к нормальным уровням, характерным для необработанных образцов. В пяти популяциях, подвергнутых воздействию мутагенов, не наблюдалось значимых различий по сравнению с необработанными, что указывает на селекцию резистентных вариантов. Действительно, секвенирование выявило уникальные мутации в популяции вируса, подвергавшейся лечению рибовирином; для подтверждения широкой резистентности к РНК-мутагенам различной структуры вариант COA virus B three A 3 72 V с высокой точностью репликации, первоначально выделенный в ходе скрининга, был протестирован на снижение чувствительности к различным концентрациям РНК-мутагенов: рибовирина, 5-фторурацила и 5-азацитидина.

Клетки обрабатывали указанными концентрациями рибавирина и заражали вирусом Cox AKI B трех дикого типа с множественностью заражения 0.01. Через 48 часов после заражения собирали потомство вируса и определяли титры с помощью метода TCID₅₀. Здесь представлены титры дикого типа и варианта a 3 72 в зависимости от концентрации мутагена. Вариант a 3 72 стабильно демонстрировал более высокие титры, чем дикий тип.

При всех условиях, протестированных для определения кинетики одноступенчатого роста продукции вируса, наши клетки заражали с множественностью заражения 10 либо вирусом дикого типа, либо высокоточным вариантом A372V, либо репликативно-дефицитным вариантом CX64 вируса Coxsackie B3. В указанные моменты времени потомство вируса собирали из клеток и супернатантов путем циклов замораживания-оттаивания и титровали методом TCID₅₀. Повышение точности репликации у A372V не сопровождается заметным дефектом репликации в культуре тканей. Вариант CX64 демонстрирует значительную задержку кинетики репликации и достигает максимальных титров, которые на 1000 раз ниже, чем у вируса дикого типа.

При использовании подхода, описанного в данном видео, каждый секвенируемый клон происходит из уникального генома в общей популяции вируса и, следовательно, несет уникальные мутации. На этом рисунке показано типичное выравнивание после очистки последовательностей низкого качества и визуализации однонуклеотидных полиморфизмов. Общее количество однонуклеотидных полиморфизмов в популяции было подсчитано, а также отмечено число однонуклеотидных полиморфизмов, присутствующих в каждом клоне.

Например, клон, подчеркнутый линией, содержит две уникальные мутации, в то время как восемь других клонов содержат по одной уникальной мутации. Эти данные используются для составления таблицы, подобной представленной здесь. В таблице показано ранжированное распределение секвенированных клонов по количеству мутаций.

Статистическое сравнение ранжированных значений позволяет определить, существенно ли одно распределение отличается от другого. Для более простой интерпретации числовые данные, полученные в результате секвенирования и статистического анализа, могут быть представлены в виде диаграммы или гистограммы. Как показано здесь, вирус A 3 72 V вызывает меньше мутаций, чем дикий тип, и демонстрирует значительно более низкую частоту мутаций при значении P менее 0.01.

Одна и та же популяция вируса Ганга кур дает схожую частоту мутаций независимо от того, используется ли стоковый раствор вируса или его разведение в 10⁵ раз для экстракции РНК. Следуя данной процедуре, вы можете провести биохимические анализы in vitro или исследования по кристаллизации, чтобы лучше понять механистические и структурные основы точности данной формы полимеразы.

После этой разработки данный метод открыл исследователям в области биологии возможность изучить корреляцию между генетическим разнообразием и приспособленностью вируса in vivo. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как повысить шансы на выделение вариантов РНК-вируса с различной точностью репликации и как использовать частоту мутаций для выявления этих различий в точности.