Анализ поглощения кальция в митохондриях: метод измерения поглощения кальция в изолированных митохондриях, основанный на считывателе планшетов

Митохондрии поглощают цитозольный кальций, так как он необходим для их правильного функционирования.

Чрезмерный приток кальция в митохондриальный матрикс - перегрузка митохондриальным кальцием - вызывает открытие внутреннего мембранного канала, переходной поры митохондриальной проницаемости, или MPTP. Открытая пора позволяет увеличить отток кальция из митохондрий, вызывая митохондриальную дисфункцию.

Чтобы измерить поглощение кальция митохондриями, начните с многолуночного планшета, содержащего изолированные митохондрии, взвешенные в подходящем буфере. Дополните лунку пируватом и малатом, которые являются субстратами, производящими АТФ. Перемешайте содержимое лунки, и выведите инкубацию.

Во время инкубации пируват и малат превращаются в АТФ, заряжая энергией митохондрии. Добавьте раствор, содержащий непроницаемые для митохондриальных мембран, чувствительные к кальцию молекулы флуоресцентных красителей. Подайте кальцийсодержащий буфер в возбужденные митохондрии.

Следите за флуоресценцией кальция в красителе по мере того, как молекулы красителя связываются со свободным кальцием в буфере.

Добавьте больше ионов кальция, чтобы инициировать приток кальция в митохондрии. Постепенно увеличивающееся количество митохондриального кальция уменьшает количество ионов кальция в буфере, снижая флуоресценцию кальция красителя.

Как только митохондрии достигают своей максимальной несущей способности к кальцию, дальнейшее добавление ионов кальция открывает каналы MPTP и импортирует кальций в буфер. Буферный кальций связывается с молекулами красителя, вызывая повышенную флуоресценцию красителя кальция.

Нанесите график флуоресценции красителя в разные моменты времени добавления кальция, чтобы контролировать кинетику поглощения кальция митохондриями.

Чтобы начать измерение поглощения кальция митохондриями с помощью планшетного ридера, запрограммируйте считыватель на выполнение кинетического считывания флуоресценции зеленого кальция-5N каждую секунду в течение 1000 секунд.

Запрограммируйте инжекторы реагентов на дозирование 5 микролитров раствора хлорида кальция в различные моменты времени. Затем загрунтуйте форсунки раствором хлорида кальция, который будет использоваться.

Затем добавьте 200 микрограммов изолированных митохондрий в одну лунку 96-луночного планшета и добавьте соответствующий объем буфера хлорида калия, чтобы достичь общего объема в 197 микролитров. Затем добавьте 1 микролитр 1 молярного пирувата, 1 микролитр 500 миллимолярного малата и 1 микролитр 1 миллимолярного зеленого кальция 5N и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования.

Инкубируйте в защищенном от света месте при комнатной температуре в течение 2 минут, чтобы митохондрии зарядились энергией. Наконец, запустите предварительно запрограммированный кинетический протокол и контролируйте флуоресценцию зеленого кальция-5N.