Анализ поглощения кальция в митохондриях: метод измерения поглощения кальция в изолированных митохондриях, основанный на считывателе планшетов

Митохондрии поглощают цитозольный кальций, так как он необходим для их правильного функционирования.

Чрезмерный приток кальция в митохондриальный матрикс - перегрузка митохондриальным кальцием - вызывает открытие внутреннего мембранного канала, переходной поры митохондриальной проницаемости, или MPTP. Открытая пора позволяет увеличить отток кальция из митохондрий, вызывая митохондриальную дисфункцию.

Чтобы измерить поглощение кальция митохондриями, начните с многолуночного планшета, содержащего изолированные митохондрии, взвешенные в подходящем буфере. Дополните лунку пируватом и малатом, которые являются субстратами, производящими АТФ. Перемешайте содержимое лунки, и выведите инкубацию.

Во время инкубации пируват и малат превращаются в АТФ, заряжая энергией митохондрии. Добавьте раствор, содержащий непроницаемые для митохондриальных мембран, чувствительные к кальцию молекулы флуоресцентных красителей. Подайте кальцийсодержащий буфер в возбужденные митохондрии.

Следите за флуоресценцией кальция в красителе по мере того, как молекулы красителя связываются со свободным кальцием в буфере.

Добавьте больше ионов кальция, чтобы инициировать приток кальция в митохондрии. Постепенно увелич