Подготовка E18 корковых нейронов крысы за раздробленности в микрожидкостных устройств

Здравствуйте и добро пожаловать в лабораторию доктора Ньюли Джона. В предыдущем видео мы продемонстрировали процесс изготовления устройства для нейронов — платформы, которая позволяет исследователю отделять тела нейронов от чистой аксональной фракции. Для создания этих устройств используется метод мягкой литографии, который заключается в отливке и отверждении PDMS на кремниевой пластине с предварительно нанесенным с помощью фотолитографии рисунком устройства.

В этом видео мы продемонстрируем процесс подготовки кортикальных нейронов крыс сроком E 18 и способ их загрузки в устройство для нейронов. Позвольте представить вам Киану Ли, которая проведет сегодняшние демонстрации.

Перед началом работы важно прогреть все необходимые среды и реагенты до 37 °C на водяной бане. Здесь представлены нейробазальная среда, 0,25% трипсин и DMEM с добавлением 10% FBS. Важно убедиться, что все предметы, помещаемые в ламинарный шкаф для работы с клетками, стерилизованы и протерты 70% этанолом.

Сначала поверхность вытяжного шкафа для работы с культурами тканей протирают 70% ethanol. Затем пластиковые штативы для пробирок обрабатывают распылителем с ethanol. Далее rubber ball, используемый при методе трехкратного штриха, очищают с помощью ethanol.

Важно выполнить это действие на раннем этапе, чтобы обеспечить достаточное время для высыхания. Затем необходимые реагенты протирают этанолом и переносят в вытяжной шкаф. Два фрагмента коры плода крысы E 18, представляющие один ранее препарированный мозг, помещают в пробирку объемом 15 мл, содержащую 1 мл ледяного диссекционного буфера без кальция и магния; к коре в диссекционном буфере добавляют 1 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА, доводя конечный объем до 2 мл, а конечную концентрация трипсина — до 0,125%. Пробирку объемом 15 мл с корой и добавленным трипсином помещают в водяную баню при 37 °C на восемь минут для инкубации коры плода в трипсине при 37 °C.

Три пастеризованные пипетки подвергаются огневому полированию. Кончик стеклянной пипетки помещают в пламя, касаясь синей части, и медленно вращают до тех пор, пока отверстие не окрасится в оранжевый цвет. Когда отверстие стало оранжевым.

Важно постоянно вращать стеклянную пипетку, чтобы она не сплющилась. Обратите внимание, что диаметры отверстий стеклянных пипеток последовательно уменьшаются. Также важно следить за тем, чтобы отверстия не были слишком узкими, так как это может привести к лизису клеток после инкубации коры в течение восьми минут при 37 °C с трипсином. Для остановки реакции трипсина к коре добавляют 10 mls DMEM, содержащего 10% FBS.

Пробирку объемом 15 мл, содержащую кору и DMEM с 10% FBS, центрифугируют при 2 500 об/мин в течение двух минут. В шкафу биологической безопасности с помощью вакуумного аспиратора, присоединенного к стеклянной пипетке, удаляют супернатант из пробирки с корой, стараясь не задеть и не переместить осадок.

К осадку коры добавляют 1 ml нейрональной базальной среды, содержащей B 27 и глутамат, и осторожно перемешивают содержимое с помощью дозатора. Очень важно избегать образования пузырьков воздуха при перемешивании, так как они могут повредить клетки вследствие окисления. Затем для тритурирования коры используют огнеполированную пастертовскую пипетку с максимально широким отверстием, закрепив на ее конце стерильную резиновую грушу и выполнив перемещение жидкости вверх-вниз примерно пять раз.

Следите за тем, чтобы не допустить появления пузырьков воздуха. Процесс повторяют с двумя другими стеклянными пипетками, каждая из которых имеет меньший диаметр отверстия. Как было указано ранее, важно убедиться, что в процессе тройного расслоения не образуются пузырьки.

Также вы должны заметить, что видимые фрагменты больше не наблюдаются. Важно продолжать тритурацию до тех пор, пока в среде не останется никаких фрагментов коры. После тритурации клетки снова центрифугируют при 2 500 об/мин в течение двух минут.

Это приблизительный размер осадка, который можно ожидать при использовании двух фрагментов коры. После центрифугирования супернатант снова удаляют из клеточного осадка. После удаления супернатанта к коре добавляют 1 ml нейробазальной среды, содержащей B 27 и глутамат, и используют её для ресуспендирования коры.

Осадок клеток снова осторожно перемешивают пипетированием, чтобы избежать образования пузырьков воздуха и обеспечить равномерное распределение и диспергирование клеточной массы. К клеточной суспензии добавляют еще 1 мл нейрональной базальной среды, доводя конечный объем до 2 мл. Затем ресуспендированный раствор клеток фильтруют через клеточный фильтр BD Biosciences с размером пор 40 мкм для последующего подсчета клеток и оценки их жизнеспособности.

В стерильную микроцентрифужную пробирку помещают 60 µL свежей базальной среды для нейронов. Затем к 60 µL базальной среды для нейронов добавляют 20 µL клеточной суспензии и, наконец, к клеткам в базальной среде добавляют 20 µL трипанового синего. После окрашивания трипановый синий окрасит клетки, которые более не являются жизнеспособными.

Мы переносим 20 мкл на гемоцитометр и рассматриваем их под микроскопом. Жизнеспособные клетки выглядят прозрачными и полупрозрачными, в то время как клетки с поврежденными мембранами окрашиваются в синий цвет благодаря трипановому синему. Обычно мы получаем около 2,5 миллионов клеток и 8 миллионов клеток на одну кору.

Обычно мы берем два фрагмента коры из одного мозга, ресуспендируя клетки в конечном объеме 2 мл. Таким образом, конечная концентрация клеток обычно составляет от 2,5 млн клеток/мл до 8 млн клеток/мл. Как правило, мы загружаем около 20 мкл клеток в каждое устройство.

Таким образом, количество клеток на одно устройство составляет от 50 000 клеток до 160 000 клеток. Плотность посева клеток может варьироваться в зависимости от целей исследования. Однако посев первичных нейронов при слишком низкой плотности обычно приводит к гибели клеток. Ранее подготовленные устройства, содержащие базальную среду для нейронов, помещают в бокс биологической безопасности для соблюдения стерильности.

Излишки среды из лунок удаляют с помощью вакуумного аспиратора. Однако следует проявлять осторожность, чтобы не удалить всю среду. В основном канале должно остаться некоторое количество среды; аспирируйте среду только из резервуаров.

В верхний левый резервуар устройства вносят всего 20 µL суспензии клеток. Клетки поступают в устройство и прикрепляются к поверхности, обработанной PLL. Здесь видно, как клетки перемещаются по основному каналу, и становится заметно, что некоторые из них уже прикрепились к стеклу.

После загрузки устройства с клетками помещают обратно в инкубатор примерно на 10 минут для прикрепления клеток. По истечении 10 минут в инкубаторе устройства снова переносят в бокс биологической безопасности, заполняют резервуары средой, после чего устройства возвращают в инкубатор. Следует отметить, что в зависимости от типа инкубатора и требуемого уровня влажности среду в устройствах может потребоваться менять каждые два-три дня.

Рекомендуется сначала поместить свежую среду в верхние лунки и дать ей протечь через устройство в основные каналы, прежде чем полностью заполнять все резервуары. Нейроны визуализированы здесь с помощью кальциевого красителя, проникающего в клетку и окрашивающего живые клетки. Здесь виден соматический отсек или клеточная сторона устройства, в которой расположены тела клеток, аксоны и дендриты.

При панорамировании устройства видны микроканавки, по которым растут аксоны, чтобы достичь противоположной стороны устройства — стороны аксонов, содержащей чистую аксональную фракцию. В демонстрационных целях эти флуоресцентно меченые клетки будут использованы для иллюстрации процедуры аксотомии.

Одной из особенностей нейронного устройства является то, что оно позволяет исследователю проводить аксотомию, то есть отсечение аксонов от чисто аксональной фракции устройства. Это необходимо для проведения таких исследований, как изучение регенерации аксонов. Сейчас Киано продемонстрирует выполнение аксотомии в нейронном устройстве; аксотомия осуществляется с помощью вакуума.

Стерильную стеклянную пипетку помещают в нижнее отверстие лунки со стороны аксонов, после чего среду аспирируют с помощью вакуума. Вся среда полностью удаляется из аксональной части устройства, включая среду в основном канале. Чтобы повторить этот процесс после удаления среды, в основной канал под давлением вводят 150 µL среды, поместив наконечник пипетки в отверстие основного канала и с силой нажав на поршень пипетки.

Затем вакуум подается на отверстие основного канала и верхний колодец аксональной стороны устройства. Вакуум снова используется для удаления всей среды с аксональной стороны, включая основной канал. Затем в основной канал повторно принудительно вводят 150 µL среды, поместив наконечник пипетки в отверстие основного канала и с силой нажав на поршень пипетки.

На данном этапе исследователь может осмотреть устройство под микроскопом, чтобы проверить эффективность перерезания аксонов. Если аксоны перерезаны недостаточно, процесс можно повторить при необходимости. В этом видео мы продемонстрировали, как подготовить кортикальные нейроны эмбриона крысы на стадии E 18 и загрузить их в устройство для нейронов.

Основным преимуществом этих устройств является возможность разделения и компартментализации культивирования тел нейронов на одной стороне устройства и чистой аксональной фракции на другой стороне. Надеемся, что это видео было для вас информативным и полезным. На этом всё, с вами была лаборатория Джона.

Спасибо за просмотр.