Подготовка E18 корковых нейронов крысы за раздробленности в микрожидкостных устройств

Здравствуйте и добро пожаловать в лабораторию доктора Нью Джона. В предыдущем видео мы продемонстрировали, как мы производим нейронное устройство, платформу, которая позволяет исследователю отделять клеточные тела нейронов от чистой аксональной фракции. Мягкая литография — это метод, используемый для изготовления устройств, который заключается в отливке и отверждении PDMS на кремниевой пластине, содержащей конструкцию устройства, которая ранее была изготовлена с помощью фотолитографии.

В этом видео мы продемонстрируем подготовку кортикальных нейронов крысы spro dolly E 18, а также то, как загрузить нейроны в нейронное устройство. Я хотел бы познакомить вас с Кианой Ли. Сегодня она будет проводить демонстрации.

Перед началом работы важно нагреть на водяной бане все необходимые среды и реагенты до 37 градусов. Вы можете увидеть нейробазальные среды 0,25% трипсина и DMEM, содержащие 10% FBS. Важно убедиться, что все, что помещается в колпак, которое будет использоваться для ремонта камер, было стерилизовано и протерто 70% этанолом.

Сначала вытяжка для культуры тканей протирается 70% этанолом. Затем пластиковые решетки, используемые для удержания трубок, опрыскиваются этанолом. Затем резиновый шарик, используемый в процессе тройной полосатости, очищается этанолом.

Важно сделать это как можно раньше, чтобы у него было достаточно времени для высыхания. Далее необходимые реактивы протираются этанолом и перемещаются в капот. Два кусочка коры головного мозга плода крысы E 18, представляющие один ранее расчлененный мозг, помещают в пробирку объемом 15 мл, содержащую один мл, ледяной, не содержащий кальция и магния буфер для расслоения, один мл 0,25% трипсина ЭДТА, добавляется в кору головного мозга в буфере для рассечения, доводя конечный объем до двух миллей и концентрацию конечного триина до 0,125%. Затем помещают пробирку объемом 15 мл, содержащую кору с добавленным трипсином. На водяной бане при температуре 37 градусов в течение восьми минут, в то время как кора головного мозга плода инкубируется при температуре 37 градусов в трипсин.

Три пастообразные пипетки отполированы огнем. Кончик стеклянной пипетки помещается в контакте с пламенем рядом с синей частью пламени и медленно вращается до тех пор, пока отверстие не станет оранжевым. Как он стал оранжевым.

Важно постоянно вращать стеклянную пипетку, чтобы она не схлопнулась. Обратите внимание, что отверстия стеклянных пипеток последовательно уменьшаются. Также важно отметить, что вы не должны делать отверстия слишком маленькими, так как это может вызвать лизис клеток после того, как кора была инкубирована в течение восьми минут при температуре 37 градусов с трипсином, 10 мл DMEM, содержащего 10% FBS, добавляется в кору головного мозга, чтобы помочь остановить реакцию трипсина.

Пробирка объемом 15 мл, содержащая кору головного мозга и DMEM 10% FBS, центрифугируется при 2 500 об/мин в течение двух минут. В шкафу биобезопасности вакуумный отсос, прикрепленный к стеклянной пипетке, используется для удаления надосадочной жидкости из коры головного мозга. Будьте осторожны, чтобы не потревожить и не сместить гранулу.

Один мл нервной базальной среды, содержащей В27 и глутамат, добавляют в кору головного мозга и осторожно пипетируют вверх и вниз. Очень важно не создавать пузырьков воздуха во время пипетирования вверх и вниз, так как пузырьки воздуха могут повредить клетки в результате окисления. Затем отполируйте заднюю пипетку с самым широким отверстием, используемым для обработки коры головного мозга путем прикрепления стерильной резиновой груши к концу пипетки и пипетирования вверх и вниз примерно пять раз.

Будьте осторожны, чтобы не попасть в пузырьки воздуха. Хорошо. Процесс продолжился с двумя другими стеклянными пипетками, каждая из которых имеет уменьшенный размер отверстия. Как уже говорилось ранее, важно следить за тем, чтобы в процессе трибрикации не образовывались пузырьки.

Вы также должны заметить, что больше не видите видимых фрагментов. Важно сохранять рейтинг tri до тех пор, пока вы больше не сможете видеть ни один из участков коры головного мозга в средствах массовой информации. После этого ячейки снова центрируются сплавлением при 2500 об/мин в течение двух минут.

Это примерно такой же размер гранулы, как можно было бы ожидать от двух кусочков коры. После центрифугирования супнатин еще раз удаляется из клеточной гранулы. После удаления супернатина один мл нейробазальной среды, содержащей В27 и глутамат, добавляется в кору головного мозга и используется для реанимации и суспензии коры.

Клеточную гранулу еще раз осторожно пипетируют вверх и вниз, чтобы избежать образования пузырьков и обеспечить равномерное распределение и разрушение клеточной гранулы. В клеточную суспензию добавляют еще один мил нейробазальной среды, доводя итоговый объем до двух мил. Затем ресуспендированный клеточный раствор фильтруют через клеточный фильтр BD biosciences 40 микрон рядом с ним для подсчета клеток и оценки жизнеспособности.

60 микролитров свежей нервной базальной среды помещают в стерильную микропробирку. 20 микролитров клеток затем добавляют к 60 микролитрам нейробазальной среды, и, наконец, 20 микролитров трианового синего добавляют к клеткам нейробазальной среды. Триановый синий окрашивает клетки, которые больше не являются живыми после того, как они были окрашены триановым синим.

Пипетируем 20 микролитров на гемоцитометр и рассматриваем их под микроскопом. Жизнеспособные клетки кажутся прозрачными и полупрозрачными, в то время как клетки с проколотыми мембранами окрашиваются в синий цвет из-за трианового синего. Как правило, мы получаем около 2,5 миллионов клеток и 8 миллионов клеток на кору головного мозга.

Обычно мы получаем два кусочка коры головного мозга из одного мозга с ресуспендированными клетками в конечном объеме в два мила. Таким образом, конечная концентрация клеток обычно составляет от 2,5 до 8 миллионов клеток на мил. В норме мы загружаем около 20 микролитров ячеек на одно устройство.

Это дает нам диапазон ячеек на устройство от 50 000 до 160 000 ячеек. Плотность ячеек может варьироваться в зависимости от области применения. Тем не менее, засеивание первичных нейронов при слишком низкой плотности обычно приводит к гибели клеток.

Излишки среды из скважин удаляются с помощью вакуумной секции. Тем не менее, нужно быть осторожным, чтобы не удалить все носители. В основном русле должно быть какое-то средство, только аспираторные среды из резервуаров.

Всего 20 микролитров клеток подается на верхний левый резервуар устройства. Клетки поступают внутрь устройства и прикрепляются к обработанной ФАПЧ поверхности. Здесь вы можете видеть клетки, которые стекают вниз по основному каналу, и вы начнете видеть, как некоторые из них на самом деле прикреплены к стеклу.

После загрузки устройства, содержащие клетки, помещаются обратно в инкубатор примерно на 10 минут, чтобы позволить клеткам прикрепиться. После 10 минут пребывания в инкубаторе устройства еще раз заносятся в шкаф биобезопасности, а резервуары заполняются средами и затем устройства помещаются обратно в инкубатор. Некоторые важные моменты, на которые следует обратить внимание, в зависимости от инкубатора и уровня влажности, необходимого для среды, могут нуждаться в замене устройств каждые два-три дня.

Хорошей практикой является размещение свежего материала в верхних лунках и предоставление некоторого количества свежего материала течь через устройство в основные каналы перед заполнением всех резервуаров. Нейроны здесь визуализируются с помощью кальция как клеточного красителя, который окрашивает живые клетки. Здесь вы можете увидеть отсек so или клеточную сторону устройства, которая содержит клеточные тела, аксоны и дендриты.

По мере того, как мы перемещаемся по устройству, вы можете видеть микробороздки, через которые аксоны прорастают, чтобы достичь другой стороны устройства, стороны аксона, которая содержит чистую аксональную фракцию. В демонстрационных целях. Эти флуоресцентно меченые клетки будут использоваться для иллюстрации процедуры топорной ототомии.

Одним из свойств нейронного устройства является то, что оно позволяет исследователю выполнять экс-ототомию, то есть вырезать аксоны из чистой аксональной фракции устройства. Для того, чтобы проводить такие исследования, как изучение регенерации аксонов. Теперь Keano продемонстрирует выполнение ex otomy в нейронном устройстве, ex otomy выполняется вакуумом.

В нижнее отверстие лунки со стороны аксона помещается пипетка из стерильного стекла, среда отсасывается вакуумом. Все носители полностью удалены с аксональной стороны устройства, включая носители в основном канале. Чтобы повторить процесс после удаления среды, 150 микролитров среды нагнетается в основной канал, помещая кончик пипетки в отверстие основного канала и с силой нажимая на пипетку.

Далее вакуум подается на отверстие основного канала и верхнюю яму аксональной стороны устройства. Вакуум снова используется для удаления всех носителей со стороны аксональных, включая основной канал. И снова 150 микролитров среды нагнетается в основной канал, если поместить кончик пипетки в отверстие основного канала и с усилием надавить на пипетку.

На этом этапе исследователь может рассмотреть устройство под микроскопом, чтобы проверить эффективность резки аксонов. Если аксоны недостаточно обрезаны, то процесс можно повторить снова по мере необходимости. В этом видео мы показали вам, как подготовить корковые нейроны E 18 плода и загрузить их в нейронное устройство.

Основным преимуществом этих устройств является возможность отделять и разделять культивирование тел нейронных клеток на одной стороне устройства от чистой аксональной фракции на другой стороне устройства. Надеемся, это видео было для вас информативным и полезным. Вот и все из лаборатории Джона.

Спасибо за просмотр.