Интерференционно-отражательная микроскопия для безметочной визуализации динамики микротрубочек

Микроскопия интерференционного отражения позволяет визуализировать микротрубочки, которые динамически растут и уменьшаются.

Закрепите парафиновые полоски на одном покровном листе, а сверху положите покровное стекло чуть меньшего размера. Нагревайте, чтобы парафин расплавился, образуя герметичный канал. Пипеткой проведите через канал раствор, содержащий антитела. Антитела прикрепляются к поверхности покровного стекла. Добавьте блокирующий раствор, блокирующий несвязанные антителами участки и предотвращающий связывание неспецифических белков.

Поместите покровное стекло на предметный столик микроскопа. Установите нагреватель образцов на температуру, способствующую росту микротрубочек.

Семена микротрубочек пипетки стабилизированы негидролизуемым гуанозинтрифосфатом, ГТФ, аналогом. Семена связываются с покровным стеклом, покрытым антителами. Добавьте буфер, содержащий немеченый тубулин, ГТФ и восстановители.

При оптимальных температурных и буферных условиях семена действуют как центры зародышеобразования, обеспечивая связывание немеченых тубулинов и рост микротрубочек.

Начните визуализацию. Падающий свет фокусируется через апертурную диафрагму на светоделитель, который частично отражает свет на объектив, освещая образец. Интерфейс стекла и буфера крышного стекла частично отражает падающий свет. Оставшийся падающий свет проходит через границу раздела буфер-микротрубочка и отражается на ней.

Основываясь на расстоянии между микротрубочками и покровным сдвигом, отраженные лучи от двух границ раздела интерференционируют, создавая конструктивную интерференцию — лучи объединяются для получения яркого сигнала, или деструктивную интерференцию — лучи гасятся, чтобы получить темный сигнал.

Визуализируйте микротрубочки в виде высококонтрастных изображений. Делайте цейтраферные изображения, обнаруживая рост и уменьшение микротрубочек.

Для начала вставьте зеркало 50/50 в колесо фильтров флуоресцентного микроскопа с помощью соответствующего фильтрующего куба. Обращайтесь с зеркалами осторожно, так как чаще всего они имеют антибликовое покрытие. Обратитесь к объективу с большим увеличением, который также имеет высокую числовую апертуру. Тот, что показан здесь, представляет собой 100-кратный масляный объектив с числовой апертурой 1,3.

Затем с помощью лезвия бритвы и предметного стекла микроскопа в качестве прямого края отрежьте полоски пластиковой парафиновой пленки шириной 3 миллиметра. Положите две полоски пластиковой парафиновой пленки на расстоянии 3 миллиметра друг от друга на чистую покровную крышку размером 22 на 22 миллиметра. Затем поместите покровную крышку размером 18 на 18 миллиметров поверх полос, чтобы образовался канал.

Перенесите покровное стекло в нагревательный блок при температуре 100 градусов Цельсия на 10-30 секунд, чтобы парафиновая пленка образовала герметичный канал. С помощью пипетки влейте 50 микрограммов на миллилитр антиродаминового антитела путем перфузии и инкубируйте предметное стекло в течение 10 минут.

После инкубации промыть канал пять раз с помощью фильтрованного BRB80. Затем влейте 1% полоксамер 407 в отфильтрованный BRB80, чтобы заблокировать поверхность от неспецифического связывания, и инкубируйте предметное стекло в течение 10 минут. Снова промойте канал пять раз с помощью фильтрованного BRB80.

Чтобы предотвратить высыхание образца, добавьте две капли отфильтрованного BRB80 на концах канала и при необходимости добавьте больше буфера. Поместите образец на предметный столик микроскопа и включите источник света с эпиподсветкой. Сфокусируйтесь на краю парафиновой пленки, чтобы найти поверхность образца, а затем переместите поле, чтобы установить вид к центру камеры. Вы будете наблюдать несколько поверхностей, когда объектив перемещается вверх и вниз из-за обратного отражения света от оптики в оптическом пути.

Затем центрируйте периферийную диафрагму в поле зрения, закрыв ее наполовину и с помощью регулировочных винтов Как только диафрагма будет правильно выровнена, откройте ее обратно. Затем вставьте линзу Бертрана, чтобы увидеть заднюю фокальную плоскость, также известную как выходной зрачок объектива.

Закройте апертурную диафрагму за краями выходного зрачка, и с помощью регулировочных винтов центрируйте апертурную диафрагму по отношению к выходному зрачку. Перепроверьте, открыв апертурную диафрагму и совместив ее края с краями выходного зрачка. Затем установите апертурную диафрагму примерно на 2/3 от числовой апертуры объектива.

Чтобы получить изображение динамики микротрубочек с помощью тубулина головного мозга, начните с установки температуры нагревателя образца на 37 градусов Цельсия. С помощью пипетки влейте 10 микролитров стабилизированных GMPCPP семян микротрубочек и контролируйте их связывание с поверхностью, визуализируя поверхность в реальном времени. После того, как от 10 до 20 семян будут связаны в поле зрения, промойте образец, используя в два раза больший объем канала, чем предварительно подогретый и отфильтрованный BRB80.

Далее влейте 10 микролитров полимеризационной смеси.

Чтобы измерить рост микротрубочек, настройте интервальную съемку с помощью программного обеспечения для сбора данных для получения изображения каждые 5 секунд в течение 15 минут. Увеличьте контрастность, получив среднее изображение 10 в каждой временной точке. Получите фоновые изображения, как показано в предыдущем разделе. Рассчитайте медиану, перейдя в раздел «Изображение», выбрав «Стек», затем «Z-проект», затем «Медиана». Вычтите соответствующий фон, перейдя в Процесс, перейдя в Калькулятор изображений и выбрав Вычесть из выпадающего меню. Убедитесь, что отмечена опция 32-битного результата с плавающей точкой.

Для уменьшения микротрубочек можно получать изображения со скоростью 100 кадров в секунду, установив временную задержку равным нулю и сохранив время экспозиции на уровне 10 миллисекунд.