Визуализация динамики связи актина и микротрубочек in vitro с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF)

Несмотря на множество примеров координации, большинство исследований изучают белки актина или микротрубочек по отдельности. Этот метод позволяет визуализировать оба динамических полимера в одной реакции. Этот метод позволяет пользователю оценивать различные регуляторные белки на предмет эмерджентных свойств, которые можно увидеть только с динамическими версиями актина и микротрубочек.

Этот метод может быть расширен, чтобы включить липиды или экстракты, чтобы приблизиться к созданию синтетической клетки. Начните с размораживания аликвот порошков PEG-Silane и Biotin-PEG-Silane и растворения порошков PEG в 80% этаноле для получения растворов для покрытия 10 миллиграммов на миллилитр mPEG-Silane и от двух до четырех миллиграммов на миллилитр Biotin-PEG-Silane. Снимите чистую крышку из хранилища этанола с помощью щипцов.

Высушите газообразным азотом и храните в чистой чашке Петри. Покройте крышку 100 микролитрами раствора покрытия и инкубируйте их при температуре 70 градусов Цельсия в течение не менее 18 часов или до использования. Вырежьте 12 полосок двухсторонней ленты длиной 24 миллиметра.

Снимите одну сторону подложки ленты и закрепите куски ленты рядом с шестью канавками, присутствующими на чистой камере визуализации. Снимите второй кусок ленты, чтобы обнажить липкую сторону ленты вдоль каждой канавки камеры, и поместите ленту камеры стороной вверх на чистую поверхность. Смешайте эпоксидную смолу и растворы отвердителей один к одному в небольшой весовой лодке и используйте наконечник P1000, чтобы поместить каплю смешанной эпоксидной смолы между ленточными полосами на конце каждой канавки камеры визуализации.

Затем поместите камеру, ленту или эпоксидную смолу стороной вверх, на чистую поверхность. Снимите крышку с покрытием из инкубатора при температуре 70 градусов Цельсия и промойте покрытые и непокрытые поверхности крышки двойной дистиллированной водой шесть раз. Высушите фильтрованным газообразным азотом, а затем прикрепите к камере визуализации с помощью крышки скользящего покрытия стороной к ленте.

Используйте наконечник пипетки P200 или P1000 для оказания давления на интерфейс заклеенного стекла, чтобы обеспечить хорошее уплотнение между лентой и крышкой. Инкубируйте собранные камеры при комнатной температуре в течение не менее пяти-10 минут, чтобы эпоксидная смола полностью запечатала колодцы камеры перед использованием. Перфузионные камеры истекают в течение 12-18 часов после сборки.

Используйте перфузионный насос и последовательно обменивайтесь кондиционирующими растворами в перфузионной камере, пропуская 50 микролитров 1% BSA для грунтовки камеры визуализации. Извлеките лишний буфер из резервуара для крепления замка приманки. Затем протолкните 50 микролитров по 0,005 миллиграмма на миллилитр стрептавидина и инкубируйте в течение одной-двух минут при комнатной температуре.

Удалите лишний буфер из резервуара. Проточите 50 микролитров 1% BSA, чтобы заблокировать неспецифическое связывание и инкубировать в течение 10-30 секунд. Удалите лишний буфер из резервуара.

Затем пропустите 50 микролитров теплого 1x TIRF буфера, а затем 50 микролитров стабилизированных и 50% биотинилированных семян микротрубочек, разведенных в 1x TIRF буфере. Установите сцену или объективное нагревательное устройство для поддержания температуры от 35 до 37 градусов Цельсия в течение 30 минут до визуализации первой биохимической реакции. Затем установите интервал сбора каждые пять секунд в течение 15–20 минут.

Затем установите 488 и 647 лазерных воздействий на 50-100 миллисекунд при мощности от 5% до 10%, сначала отрегулировав реакцию полимеризации, чтобы инициировать сборку актиновой нити. Получайте изображения на расстоянии 647 нанометров и вносите соответствующие коррективы. Затем отрегулируйте реакцию полимеризации во второй кондиционированной перфузионной скважине, чтобы инициировать сборку микротрубочек.

Визуализируйте на 488 нанометрах и внесите соответствующие коррективы. Соедините три микролитра 10 микромолярного тубулина 488 с 7,2 микролитровой аликвотой 100 микромолярного флуоресцентно немаркированного тубулина не более чем за 15 минут до использования. Затем соедините три микролитра разбавленного актина, связанного с биотином, в соответствующих объемах флуоресцентно немаркированного и меченого актина таким образом, чтобы конечная смесь составила 12,5 микромолярного общего актина с флуоресцентной меткой от 10% до 30%.

Приготовьте смесь цитоскелетов, объединив два микролитра 12,5 микромолярной актиновой смеси со смесью тубулина не более чем за 15 минут до получения изображения. Хранить на льду до использования. Приготовьте белковую реакционную смесь, объединив все другие экспериментальные компоненты и белки, включая 2x TIRF-буфер, антибелок, нуклеотиды, буферы и вспомогательные белки.

Инкубируйте смесь цитоскелетов и белковую реакционную смесь отдельно при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30-60 секунд. Чтобы начать реакцию, добавьте содержимое белковой реакционной смеси в смесь цитоскелетов и перемешайте ее. Поток 50 микролитров реакционной смеси, содержащей 1x TIRF буфера, дополненного 15 микромолярными свободными тубулинами, одним миллимолярным GTP, 0,5 микромолярными мономерами актина и соответствующими объемами буферных регуляторов в перфузионную камеру.

Записывайте покадровый видеоролик с помощью программного обеспечения микроскопа для получения каждые пять секунд в течение 15-20 минут. Обусловите новую перфузионную скважину и замените буферный объем регуляторным белком, представляющим интерес, и буферными элементами управления. Приобретайте для оценки регуляторных белков для эмерджентных функций актиновых микротрубочек.

На этих изображениях показаны примеры измерений микротрубочек и динамики актиновых нитей. Средняя временная проекция канала тубулина эффективно визуализирует общую длину микротрубочек для сканирования линий, используемых для создания графиков кимографа. Черные пунктирные линии соответствуют двум примерам кимографов динамических микротрубочек.

Фазы роста и разборки микротрубочек показаны на каждом кимографе. Здесь показаны два примера монтажей покадровых изображений, изображающих активные полимеризующиеся одиночные актиновые нити. Скорости относительного удлинения рассчитываются как наклон участков длины актиновых нитей с течением времени на микромолярный актин.

Таким образом, поправочный коэффициент в два раза должен быть применен к 0,5 микромолярным актиновым реакциям для сравнения скоростей, обычно определяемых при концентрации актина в одном микромоляре. Примеры из пяти нитей показаны здесь. Здесь показаны флуоресценция полного внутреннего отражения, или TIRF изображения динамических микротрубочек в актиновых нитях, полимеризующихся при отсутствии или присутствии 250 наномоляров тау.

Синими пунктирными линиями и стрелками знака изнашивается линия, нарисованная для линии сканирования графиков, соответствующих каждому условию. Перекрытие между микротрубочками в актиновых областях может быть оценено в установленный момент времени для каждой области. Цитоскелетные белки, в частности актин, микротрубочки и их регуляторы очень чувствительны к циклам замораживания/оттаивания.

Для консистенции и успеха используйте высокочистые и правильно хранящиеся белки.