Статическая атомно-силовая микроскопия для визуализации и определения характеристик собранных нуклеосом

Нуклеосомы, основная повторяющаяся единица эукариотического хроматина, состоят из витков ДНК, обернутых вокруг ядра белков-гистонов.

Чтобы визуализировать собранные нуклеосомы с помощью статической атомно-силовой микроскопии, АСМ, начните с тонкой полоски слюды, функционализированной для придания поверхности положительного заряда. Нарежьте полоску на небольшие квадратики. Пипеткой собирают нуклеосомную суспензию.

Отрицательно заряженная ДНК в нуклеосоме связывается с положительно заряженной группой функционализированной полоски слюды посредством электростатических взаимодействий. Промойте с буфером, чтобы предотвратить переполнение нуклеосом.

Закрепите полоску слюды на опорном диске для образца. Установите ее на инструментальный столик AFM.

Прикрепите держатель щупа к оптической головке прибора. Держатель содержит предварительно установленный консоль AFM с наконечником на вершине.

Направьте лазерный луч на заднюю часть кантилевера для точного измерения прогиба. Расположите наконечник в непосредственном контакте с поверхностью, содержащей нуклеосомы.

Во время визуализации в контактном режиме, когда кончик кантилевера сканирует поверхность нуклеосомы, возникают силы отталкивания после взаимодействия между атомами наконечника и образца. Это приводит к тому, что консоль изгибается. Лазерный луч по-разному отражается и направляется на позиционно-чувствительный фотоприемник.

Контур обратной связи поддерживает постоянное отклонение кантилевера при вертикальном движении сканера во время сканирования. Этот сигнал обратной связи в дальнейшем используется для создания топографических изображений нуклеосом. Ядро нуклеосом выглядит в виде ярких пятен с тонкими рукавами, представляющими фланкирующую ДНК.

Подготовьте поверхность слюды для статической АСМ-визуализации. Для этого сначала готовят 50-миллимолярный стоковый раствор АФС в деионизированной воде. Храните 1 миллилитр аликвоты раствора при температуре 4 градуса Цельсия, пока он не понадобится.

Из исходного раствора готовят рабочий раствор АФС для модификации слюды, растворяя 50 микролитров 50-миллимолярного запаса АФС в 15 миллилитрах дистиллированной деионизированной воды. Смешайте раствор, а затем заполните раствором кювету.

Далее вырезаем 1 на 3-сантиметровые полоски слюды из качественных листов слюды. Убедитесь, что деталь помещается по диагонали в кювете. Затем раскалывайте слои слюды до тех пор, пока обе стороны не станут свежераскалывающимися, а кусок не станет толщиной 0,1 миллиметра.

Немедленно поместите кусочек слюды в кювету, наполненную APS, и инкубируйте слюду в течение 30 минут. Переложите кусочек слюды в кювету, наполненную дистиллированной деионизированной водой, и замочите ее на 30 секунд. Затем с помощью аргона полностью высушите обе стороны полоски APS-слюды.

Наклейте двусторонний скотч на несколько магнитных шайб и расположите их в стороне. Затем нарежьте подложку из APS-слюды на квадраты размером 1 сантиметр на 1 сантиметр и накройте их чистой чашкой Петри. Затем готовят три разведения собранных нуклеосом с использованием фильтрованного буфера толщиной 0,22 мкм, содержащего 10-миллимолярный HEPES и 4-миллимолярный хлорид магния при pH 7,5.

Чтобы ограничить потерю нуклеосом при низкой конечной концентрации, разведение следует проводить по одному, непосредственно перед осаждением на APS-слюду.

Поместите от 5 до 10 микролитров каждого образца нуклеосом в центр кусочка APS-слюды и дайте им инкубироваться в течение 2 минут. Затем аккуратно промойте образец от 2 до 3 миллилитров дистиллированной деионизированной воды, чтобы удалить буферные компоненты, и высушите осажденный образец под легкой струей аргона.

Для начала установите наконечник на держатель наконечника установки AFM. Затем установите первый образец на столик АСМ, стараясь не соприкасаться с поверхностью образца. Расположите лазер над консолью до тех пор, пока его сумма не достигнет максимума, и отрегулируйте значения вертикального и бокового отклонения до значения, близкого к 0. Затем настройте зонд АСМ, чтобы найти его резонансную частоту. Отрегулируйте амплитуду привода и установите размер изображения на 100 на 100 нанометров. После настройки нажмите кнопку «Вовлечь», чтобы начать подход.

Когда подход будет завершен, постепенно оптимизируйте заданное значение амплитуды до тех пор, пока поверхность образца не станет четко видна. Затем увеличьте размер сканирования до 1 микрон на 1 микрон и разрешение до 512 на 512 пикселей. Наконец, нажмите кнопку «Захват», чтобы начать получение изображения.