Идентификация субпопуляций регуляторных Т-клеток из дренирующих лимфатических узлов поджелудочной железы мышей

Регуляторные Т-клетки, или Tregs, представляют собой специализированную субпопуляцию Т-клеток, которая оказывает иммуносупрессивное действие, опосредуя гомеостаз иммунной системы. Tregs экспрессируют маркеры клеточной поверхности CD4, CD25 и Neuropilin 1, Nrp1, а также ядерные факторы транскрипции forkhead box P3, Foxp3 и Helios.

Чтобы изолировать Tregs от дренирующих лимфатических узлов поджелудочной железы мыши, или PDLN, поместите металлическую сетку на коническую трубку. Поместите PDLN на сетку и измельчите ткань, чтобы механически диссоциировать ее. Добавьте подходящую среду поверх сетки, промыв ячейки в трубку.

Центрифуга, удаляющая мертвые клетки и клеточный мусор. Ресуспендируйте жизнеспособные клетки в среде. Пропустите клетки через крышку клеточного фильтра, прикрепленную к трубке с круглым дном, чтобы получить однородную одноклеточную суспензию, удаляя любые оставшиеся клеточные комки.

Добавьте фторохром-конъюгированные анти-CD4, анти-CD25 и анти-Nrp1 антитела. Анти-CD4 и анти-CD25 антитела связываются с соответствующими антигенами клеточной поверхности на Tregs. В то же время анти-Nrp1 связывается с рецепторами Nrp1.

Обработайте клетки подходящим буфером для фиксации пермеабилизации, фиксирующим клетки и проникающим в клеточные и ядерные мембраны. Добавьте фторохром-конъюгированные антитела, нацеленные на Foxp3 и Helios.

Проникающие мембраны позволяют антителам проникать в клетки и связываться с их соответствующими внутриядерными мишенями. Анализируйте клетки с помощью проточной цитометрии.

Tregs характеризуются положительной экспрессией CD4, CD25 и Nrp1 на клеточной поверхности, а также ядерных транскрипционных факторов Foxp3 и Helios.

Сначала поместите 15-миллилитровую коническую трубку в решетку. Поместите на трубку стерильную металлическую сетку толщиной 250 микрометров. Промойте сетку 1 миллилитром RPMI. Далее перенесите лимфатические узлы на металлическую сетку, и с помощью пинцета протрите их через сетку. Нанесите 1 миллилитр RPMI на сетку, чтобы промыть клетки в трубку. Повторите этот процесс переноса и измельчения лимфатических узлов по три раза для каждого образца, а затем удалите сетку.

Центрифугируйте пробирки при температуре 433 x g и при 4 градусах Цельсия в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки примерно в 5 миллилитрах РПМИ, затем заполните пробирки РПМИ. Повторите этот процесс от центрифугирования образцов до однократного заполнения пробирки RPMI.

Снова центрифугируйте пробирки при 433 x g и 4 градусах Цельсия в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 2 миллилитрах RPMI. Перелейте 2 миллилитра клеточной суспензии в 5-миллилитровые пробирки с круглым дном и крышками от клеточного фильтра.

Сначала центрифугируют клеточную суспензию из образцов PDLN при 433 x g и при 4 градусах Цельсия в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость. Окрасьте клетки поверхностными антителами, как указано в текстовом протоколе, и инкубируйте пробирки на льду в течение 40 минут.

Далее добавьте в каждую пробирку по 200 микролитров буфера FACS. Центрифугируйте при 433 x g и 4 градусах Цельсия в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот процесс — добавьте буфер, центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость один раз. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 микролитрах буфера для фиксации и пермеабилизации клеток.

Перенесите трубки в холодильник при температуре 4 градуса Цельсия на ночь. На следующий день центрифугируют клеточную суспензию из образцов PDLN при 433 х g и при 4 градусах Цельсия в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 500 микролитрах буфера для промывки пермеабилизации. Снова центрифугируйте клетки при 433 x g и 4 градусах Цельсия в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.

Окрашивайте клетки внутриклеточными антителами, как указано в текстовом протоколе. Инкубируйте трубки на льду в течение 1 часа. После этого добавьте в каждую пробирку по 500 микролитров буфера для промывки пермеабилизации. Центрифугируйте при 433 х г и при 4 градусах Цельсия в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах промывочного буфера для пермеабилизации.

Еще раз центрифугируйте при температуре 433 x g при температуре 4 градуса Цельсия в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 300 микролитрах буфера FACS. Затем проанализируйте клетки на проточном цитометре, как указано в текстовом протоколе.