Метод in vitro для изучения антимикробной терапии бактериальных агрегатов

Чтобы изучить влияние противомикробных препаратов на бактериальные агрегаты, возьмите культуру Pseudomonas aeruginosa в питательной среде, способствующей образованию агрегатов — имитирующей рост при инфекции.

Сконструированные бактерии экспрессируют флуоресцентный белок для обнаружения агрегатов под флуоресцентным микроскопом. Изображение в трех измерениях для вычисления объема агрегатов, или бактериальной биомассы, и визуализации увеличения биомассы с течением времени, указывающего на рост бактерий.

Добавьте колистин — катионный антимикробный пептид — в сублетальной концентрации, которая убивает восприимчивые бактерии, выбирая при этом устойчивые к антибиотикам.

Колистин связывается с отрицательно заряженными липополисахаридами, или ЛПС, на бактериальной внешней мембране, смещая катионные мостики, которые стабилизируют монослой ЛПС, нарушая целостность мембраны.

Колистин проникает в периплазму и связывается с ЛПС на клеточной мембране, разрушая мембрану и приводя к лизису клеток. В качестве контрмеханизма, специфические генетические мутации в подмножестве бактерий нейтрализуют отрицательный заряд ЛПС. Эта модификация ингибирует электростатическое взаимодействие катионного колистина с меньшим количеством анионных ЛПС, предотвращая гибель клеток.

Изображение для визуализации уменьшения биомассы со временем, указывающее на воздействие противомикробного препарата. Добавьте йодид пропидия или PI — флуоресцентный краситель — который проникает через поврежденную мембрану для связывания ДНК, помечая только мертвые клетки.

Проведите флуоресцентно-активируемую сортировку клеток, или FACS, разделяя чувствительные клетки, меченные PI, и флуоресцентно меченные клетки, устойчивые к антибиотикам. Клетки готовы к последующему анализу.

Для получения изображения агрегатов Pseudomonas aeruginosa с помощью конфокального лазерно-сканирующего микроскопа в конце инкубации обозначьте три лунки культурального планшета, которые будут повторяться в одной лунке для лечения антибиотиками, и поместите планшет на нагретый столик микроскопа.

Выберите цель для погружения в масло в 63 раза и откройте вкладку «Найти», чтобы определить скопления бактерий в светлом поле. Определите область для визуализации в каждой скважине и используйте модуль «Положения» для сохранения положения области. Установите длину волны возбуждения равной 488 нанометров, а длину волны излучения — 509 нанометров.

В модуле «Съемка» выберите параметр Z-Stack для получения изображений и используйте модуль «Усреднение линий» для уменьшения флуоресценции фона в канале GFP в пределах общего объема изображений Z-стека. Установите опцию Time Series (Временные ряды) для захвата 60 срезов в каждой лунке с 15-минутными интервалами в течение 18 часов и используйте определенную стратегию фокусировки для сохранения фокальной плоскости для каждой позиции, которая будет повторно визуализирована в каждой временной точке на протяжении всего эксперимента.

Через 4,5 часа после постановки эксперимента по визуализации визуализируйте каждую позицию, чтобы определить совокупную биомассу в каждой из четырех лунок перед добавлением антибиотика. Через шесть часов осторожно добавьте антибиотик в два раза ниже минимальной ингибирующей концентрации в середину каждой лунки, чуть ниже границы раздела воздух-жидкость, и нажмите «Начать эксперимент», чтобы начать визуализацию после лечения антибиотиками.

Чтобы изолировать живые клетки, в конце 18-часового периода визуализации пометьте бактерии в каждой лунке соответствующим объемом йодида пропидия в соответствии с рекомендациями производителя. В конце инкубации используйте изолированный контейнер для переноса планшета к проточному цитометру, а также настройте цитометр на обнаружение GFP и йодида пропидиума с помощью 70-микронной насадки. Затем пропустите 1 миллилитр аликвот каждого надосадочной жидкости культуры с наименьшей скоростью потока, чтобы отсортировать жизнеспособные GFP-положительные и нежизнеспособные пропидиум-йодид-отрицательные агрегаты Pseudomonas aeruginosa.