Человек In Vitro Борьбе как инструмент для скрининга Признание ранней стадии иммунного дисбаланса

Общая цель данной процедуры заключается в использовании анализа супрессии in vitro на клетках человека для измерения функции Treg и возможного прогнозирования будущей потери этой функции. Это достигается путем предварительного приготовления и тестирования кодированных микросфер, которые будут использоваться в качестве стимуляторов клеток. Вторым этапом является выделение чистых наивных CD4+ CD25- T-клеток, активированных in vivo CD4+ CD25low T-клеток и регуляторных CD4+ CD25high T-клеток, а также облученных BMCs из PP для использования в качестве антигенпрезентирующих клеток (APC).

Затем создаются отдельные культуры наивных или активированных Т-клеток в качестве респондентов с BMC P в качестве АПК или кокультуры в тех же условиях, но с добавлением tregs в соотношении 1:10. Заключительным этапом является сбор клеток и измерение их пролиферации по включению тритиевого тимидина. Полученные в итоге результаты могут продемонстрировать различия в подавлении ответов наивных Т-клеток по сравнению с Т-клетками, активированными in vivo.

Меня зовут Джефф Вудклифф. Регуляторные Т-клетки не экспрессируют уникальных поверхностных маркеров. Следовательно, для достоверного измерения их функции их необходимо выделять с использованием методов, обеспечивающих наилучшее разделение.

Основным преимуществом использования сортировки клеток с помощью флуоресцентно-активированного клеточного сортера по сравнению с другими методами, такими как максимальная изоляция, является высокая степень чистоты получаемых популяций клеток. Затем функции клеток можно достоверно проверить в тестах на супрессию in vitro, как показано в данной работе. Этот метод позволяет получить представление о функции treg у здоровых лиц и субъектов с сахарным диабетом 1 типа. Он также может быть применен при других аутоиммунных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит у людей, системная красная волчанка, рассеянный склероз и другие. Для покрытия активированных бусин TAAL антителами к CD3 человека.

Добавьте один миллилитр активированных бусин M four 50 toil из исходного флакона в пробирку объемом 1,5 миллилитра и поместите пробирку в магнитный штатив до тех пор, пока все бусины не прикрепятся к стенке пробирки. Затем удалите буфер для бусин, отпипетировав его, пока пробирка все еще находится в магнитном штативе. После этого извлеките пробирку из магнитного штатива и добавьте один миллилитр буфера один.

Повторяйте помещение пробирки на магнитный штатив. Удаляйте буфер, пока пробирка находится на магнитном штативе. Снова ресуспендируйте бусины в 1 mL буфера 1.

На этот раз также добавьте 40 µL антител к CD3 человека. Инкубируйте бусины с антителами при 37 °C в течение 15 минут, постоянно перемешивая. Затем добавьте 0,1% (масс./об.) BSA и продолжайте перемешивание в течение следующих 16 часов.

Затем дважды промойте гранулы буфером 2, инкубируя их в 1 mL буфера 2 в течение пяти минут при температуре от 2 до 8 °C, после чего удалите буфер, удерживая пробирку в магнитном штативе. Затем еще один раз промойте гранулы в тех же стерильных условиях.

Используя один миллилитр буфера 3, проверьте эффективность покрытия антителами, добавляя различное количество покрытых CD3 бусин на клетку, чтобы определить оптимальное соотношение; при этом посейте по 50, 20, 5 и 0 PBMCs в каждую лунку 96-луночного планшета в трех повторностях. После 72 часов культивирования при 37 °C добавьте 1 µCi тритиевого тимидина и продолжите инкубацию в течение следующих 16 часов. Соберите клетки в многоканальный планшет для сбора или аналогичный.

Добавьте сцинтилляционную жидкость и определите количество импульсов в минуту или CPM на лунку. Используя сцинтилляционный счетчик TopCount NXT или аналогичный, определите соотношение бусин к клеткам; по нашему опыту, следует выбрать то соотношение, которое стабильно дает CPM выше 5, 000, но менее 15, 000. Соотношение три бусины на одну клетку обычно обеспечивает оптимальную стимуляцию как для респондер-клеток, так и для Treg-клеток у всех протестированных субъектов-людей.

Наполните коническую пробирку объемом 50 мл 15 мл раствора fal plus. Затем проведите разведение лейкоцитарного слоя в соотношении 1:6, добавив 250 мл PBS к 50 мл лейкоцитарного слоя. Медленно наслоите 25 мл разведенного лейкоцитарного слоя поверх fial pack, стараясь не нарушить границы слоев.

Центрифугируйте при 800 ×g в течение 30 минут при температуре 4 °C. При выключенном торможении осторожно соберите слой PBMC, который представляет собой белую промежуточную фазу между фиколом и буфером. При необходимости снимите клетки со стенок пробирки.

Подождите несколько минут и снова соберите их из промежуточной фазы. Перенесите клетки в новые пробирки объемом 50 мл и промойте их, наполнив пробирки PBS, затем центрифугируйте для получения осадка. PBM cs.

Повторите стадию промывки дважды. Объединяя по два клеточных осадка в одной пробирке, в конечном итоге соберите все клеточные осадки в одну пробирку объемом 50 milliliter. Затем используйте 20 microliters суспензии клеток для определения жизнеспособности клеток методом исключения трипанового синего.

Для получения тестовых АПК перенесите 1 mL жизнеспособных PBMC в новую пробирку. Затем добавьте 4 mL среды и облучите клетки дозой 5 000 rad; пробирку с остатком PBMC долейте буфером PBS. После центрифугирования клеток при 250 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C слейте супернатант и ресуспендируйте клетки в 4 mL той же смеси.

Затем добавьте 200 µL магнитных микросфер anti-CD4 к PBMC и инкубируйте смесь клеток и микросфер при 4 °C в течение 20 минут. После инкубации промойте клетки в 40 mL PBS-буфера, затем осадите клетки центрифугированием. Слейте супернатант и ресуспендируйте клетки в 8 mL дегазированного PBS-буфера при комнатной температуре.

Затем с помощью фильтров для разделения отфильтруйте клеточную суспензию. После этого разделите суспензию ПБК на две пробирки объемом 15 мл, добавив в каждую пробирку по 4 мл ПБК.

Закрепите две колонки на сепараторе minimax и поместите пробирки для сбора под каждую колонку. Затем добавьте в каждую колонку 3 mL PBS-буфера DGAs; когда буфер закончится, нанесите весь объем клеточного раствора (4 mL) из каждой пробирки на колонки до того, как суспензия клеток полностью истощится. Добавьте в каждую колонку 3 mL PBS-буфера DGAs комнатной температуры и дайте буферу полностью пройти в пробирки для сбора.

Добавляйте буфер до тех пор, пока выходящий раствор не станет прозрачным. Пипетируйте еще 5 mL буфера DGAs на колонки LS, после чего извлеките колонки LS из сепаратора minimax. Поместите колонки в новые стерильные пробирки для сбора объемом 50 mL.

Дайте вытечь половине миллилитра, а затем медленно вытолкните оставшийся объем, который составляет примерно четыре миллилитра. Теперь объедините две положительные фракции CD4. Затем добавьте в пробирку до 50 миллилитров PBS и подсчитайте количество клеток после центрифугирования при 400 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C.

Ресуспендируйте клетки в двух миллилитрах буфера PBS. Смешайте антитела, которые будут использоваться для окрашивания, в одной пробирке: anti CD 14, CD 32, CD 16 и, по желанию, anti CD 4. Возьмите аликвоту смеси для окрашивания пробирки «без флуорохрома» (FLUOROCHROME minus one).

Подготовьте пробирку FMO, перенеся 5 µL суспензии клеток из пробирки в пробирку для проточного цитометра, и окрасьте клетки 2 µL предварительно приготовленного коктейля антител. Затем добавьте неокрашенные клетки и бусины, покрытые мышиным IgG, которые будут окрашены одним флуорохромом, в новые отдельные пробирки для проточного цитометра для использования в качестве контролей компенсации при сортинге клеток. После этого добавьте 50 µL антител к CD25 человека, меченных PE, в коктейль, и добавьте коктейль к остальной части клеточной суспензии.

Инкубируйте пробирки при 4 °C в течение 30 минут. После инкубации клеток с коктейлем антител добавьте к клеткам буфер PBS, затем осадите их центрифугированием. Ресуспендируйте осадок в буфере PBS до концентрации 10⁷ клеток/мл.

Используйте пробирку FMO для установления порога сортировки CD 25-положительных T-клеток. Используя данную стратегию гейтирования, сначала установите гейт вокруг фико-отрицательных клеток, чтобы исключить фико-положительные клетки, которые включают моноциты, макрофаги и все остальные CD 4-положительные не-T-клетки, как показано на этом рисунке. На отдельном графике определите гейты для CD 25-отрицательных и CD 25-низких T-клеток, а также CD 25-высоких treg-клеток, как показано на этом рисунке.

После проведения проточного цитофлуориметрии и сортировки субпопуляций клеток центрифугируйте пробирки для сбора и храните Т-клетки на льду до момента посева. Маркируйте 96-луночный планшет с U-образным дном согласно таблице. В лунки 96-луночного планшета внесите аликвоты по 50 µL бусин с покрытием CD3, рассчитанные исходя из концентрации 3 бусины на одну клетку-респондер на лунку, в полной среде с 10% объединенной сыворотки крови человека, затем разведите предварительно облученные APC в среде до концентрации 5×10⁵ клеток/мл.

Добавьте 50 µL клеток в 96-луночный планшет, затем внесите 2,5 × 10⁴ CD4-положительных CD25-отрицательных или CD4-положительных CD25-низких Т-клеток в каждую лунку в трех повторностях. Добавьте Treg-клетки в ряд B и в лунки, помеченные как «только Treg», в совместную культуру в соотношении от 1:1 до 1:10, как показано здесь. Затем инкубируйте планшет при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 и насыщенной влажностью в течение 72 часов. Далее проведите пульс-метку клеток 1 мкКи тритиевого тимидина и продолжите инкубацию при 37 °C в течение следующих 16 часов, чтобы тимидин встроился в последние часы совместного культивирования.

Используйте устройство для сбора клеток (filter mate harvester) для сбора клеток с многолуночного планшета для сбора. Затем накройте планшет для сбора прозрачной пластиковой крышкой, предварительно заполненной сцинтилляционным раствором. В завершение измерьте количество импульсов в минуту (CPM) для каждой лунки.

С помощью сцинтилляционного счетчика с использованием данной системы можно выделить субпопуляции Т-клеток высокой степени чистоты, что показано на следующей серии диаграмм рассеяния: здесь, в нижнем гейте, представлены CD4-положительные CD25-отрицательные Т-клетки. На следующем рисунке видны высокоочищенные CD4-положительные CD25-низкие Т-клетки. Чистая популяция CD4-положительных клеток, выделенных методом проточной сортировки.

Клетки treg с высоким уровнем экспрессии CD 25 показаны в верхнем контрольном гейте. Монокультуры APC и treg, полученные от здоровых доноров, демонстрировали незначительную пролиферацию или ее отсутствие относительно фонового уровня, что было определено по включению тимидина; в то же время наивные CD 25-отрицательные и активированные in vivo CD 25-низкие T-клетки проявляли выраженную пролиферацию, которая подавлялась при совместном культивировании этих типов клеток-респондентов с клетками treg. При этом наблюдались небольшие различия в способности treg подавлять пролиферацию наивных CD 25-отрицательных и активированных in vivo CD 25-низких T-клеток.

Контроль не был значимым. Монокультуры АПК и Treg-клеток, полученные от субъектов группы риска, демонстрировали низкую или отсутствующую пролиферацию по сравнению с фоновыми значениями, измеренными по включению тимидина. В то же время наивные CD25-отрицательные и активированные in vivo CD25-низкие T-клетки проявляли более низкий уровень пролиферации по сравнению со здоровым контролем.

T-клетки-респондеры были дополнительно подавлены tregs и в совместных культурах, так как данный анализ дает надежные результаты. Мы также можем сделать вывод, что низкие значения CPM указывают на возможные дефекты в передаче сигнала, которые следует дополнительно изучить в рамках другого типа исследования. Однако разница в способности tregs подавлять CD 25-отрицательные по сравнению с CD 25-низкими T-клетками-респондерами у лиц из группы риска была значимой.

После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как последовательно объединить все необходимые этапы для проведения успешного и надежного функционального теста на наличие Tregs у здоровых добровольцев и лиц с нарушением работы иммунной системы. Например, у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа.